血红蛋白的提取与分离

2003年4月14日美国科学家宣布人类基因组序列图完成，这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代。人类基因组：指人类DNA分子所携带的全部遗传信息。蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究。课题3血红蛋白的提取和分离一、基础知识阅读P64页第一段,思考以下问题:1、分离生物大分子的基本思路是什么2、蛋白质分离和提取的原理是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。（一）凝胶色谱法阅读教材“凝胶色谱法”，思考以下问题：1、什么是凝胶色谱法？2、凝胶色谱法分离蛋白质的依据是什么？3、在凝胶色谱法分离蛋白质过程中所用的凝胶有什么特点？4、凝胶色谱法的原理是什么？5、简述凝胶色谱法分离蛋白质的过程。1、什么是凝胶色谱法？根据被分离物质（如蛋白质）的相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来对物质进行分离的方法。2、凝胶色谱法分离蛋白质的依据是什么？蛋白质分子量的大小不同，在凝胶中的移动速度不同。3、在凝胶色谱法分离蛋白质过程中所用的凝胶有什么特点？①是一些微小的多孔球体；②是由葡聚糖或琼脂糖等多糖类化合物构成的。4、凝胶色谱法的原理是什么？分子筛效应①当不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢。②分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。5、简述凝胶色谱法分离蛋白质的过程。（二）缓冲溶液阅读教材‘缓冲溶液“，思考以下问题：1、缓冲溶液的作用是什么？2、如何配制缓冲溶液？3、如何维持缓冲溶液的PH值保持相对稳定？1、缓冲溶液的作用是什么？缓冲溶液能够在一定范围内，抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH值的相对稳定。2、如何配制缓冲溶液？通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。3、如何维持缓冲溶液的PH值保持相对稳定？缓冲溶液的PH由不同的缓冲对来调节。缓冲对都是由一种弱酸和这种弱酸的强碱盐组成

H2CO3NaHCO3

CH3COOHCH3COONa

NaH2PO4Na2HPO4

KH2PO4K2HPO4现以碳酸氢盐缓冲系统为例，说明缓冲系统在酸碱平衡调节中的作用。HClNaHCO3→NaClH2CO3盐酸是一种强酸，当其进入血液后首先与缓冲系统中的碱发生反应，生成氯化钠和碳酸，从而将强酸转变成弱酸，进而通过肺将碳酸排出，血液pH不会发生明显变化。NaOHH2CO3→H2ONaHCO3氢氧化钠是一种强碱，当其入血液后与缓冲系统中的弱酸发生反应，生成水和碳酸氢钠，从而将强碱转化成弱碱，再经肾排出。这说明当体液中酸性或碱性物质的含量发生改变时，缓冲系统通过接受H或释放H，减轻体液pH变动的程度。三电泳阅读教材”电泳”,思考以下问题:1、什么是电泳2、电泳的原理是什么？3、常用的电泳方法有哪几种？4、用聚丙烯酰胺凝胶电泳法如何测定蛋白质的分子量？1、什么是电泳带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2、电泳的原理是什么？①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3、常用的电泳方法有哪几种？琼脂糖凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳4、用聚丙烯酰胺凝胶电泳法如何测定蛋白质的分子量？①获得聚丙稀酰胺凝胶：由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶（交联的丙稀酰胺聚合体）。②原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。③消除静电荷对迁移率的影响：在凝胶中加入十二烷基磺酸钠（SDS）可消除静电荷对迁移率的影响。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。④测定蛋白质的分子量：使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。二、实验操作样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程1、样品处理：1血液组成血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个a－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团（2）血红蛋白的作用血红蛋白的每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。③选材本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。（2）红细胞的洗涤：阅读教材“红细胞的洗涤”，思考以下问题：①人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？②洗涤红细胞的目的是什么？③如何洗涤红细胞？②洗涤红细胞的目的是什么？除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。不可洗涤次数过少。①人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。③如何洗涤红细胞？A、采集血样B、低速短时间离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果）C、吸取血浆：上层透明的黄色血浆D、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为09％的氯化钠溶液洗涤E、低速离心（低速短时间）F、重复D、E步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净（3）血红蛋白的释放加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。4分离血红蛋白溶液①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min。第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）②试管中溶液层次③分离用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。5透析①过程取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为70），透析12小时。②透析目的除去样品中分子量较小的杂质。2、凝胶色谱操作：（1）凝胶色谱柱的制作①取长40厘米，内径16厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作打孔安装玻璃管④组装将上述三者按相应位置组装成一个整体⑤安装其他附属结构（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择A、材料“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。B、代表意义：交联葡聚糖凝胶（G-75）75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水75克。配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。②凝胶的前处理③凝胶色谱柱的装填方法A、固定B、装填将色谱柱垂直固定在支架上。将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：2、装填凝胶柱时不得气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。注意：2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为70）充分洗涤平衡12小时。④洗涤平衡（3）样品加入与洗脱①调节缓冲液面②滴加透析样品吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐关闭出口。③样品渗入凝胶床④洗脱加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入mol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml一试管，连续收集（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）。讨论：答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。⑥注意：正确的加样操作1、不要触及破坏凝胶面2、贴壁加样3、使吸管管口沿管壁环绕移动1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝