6-第6章-一般毒性作用及其试验与评价方法

第六章一般毒性作用及其试验与评价方法

毒性作用一般毒性作用〔急性毒性、亚慢性毒性、慢性毒性〕特殊毒性作用〔致突变作用、致癌作用、致畸作用、遗传毒性〕一般毒性作用(generaltoxicity)，也称根底毒性(basictoxicity)：是人和动物单次或反复接触食品毒物或有害因素后在躯体及靶部位所发生或表现出的急性或长期的一般性中毒病症、生理生化变化、组织病变及死亡现象。即毒物对动物机体产生的综合毒效应。根据毒物接触次数和效应发生时间长短，一般毒性作用可划分为急性毒性、〔蓄积毒性〕、亚慢性毒性和慢性毒性。第一节急性毒性作用及其评价一、根本概念。〔P122〕急性毒性〔acutetoxicity〕是指机体(人或实验动物)一次接触(或24小时内屡次接触)受试物后，在短期内所产生的效应及反响，包括一般行为、外观改变及形态改变，甚至死亡效应。观察时间：一般为7天，也可连续观察14～28天。‘一次接触’(P122)经口接触和各种方式的注射接触，“一次接触〞，是指在瞬间将受试化合物输入实验动物的体内；而经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次接触〞是指在一个特定的期间内实验动物持续地接触受试化合物的过程;此外，当化学物毒性较低时，需要给予动物较大剂量时，可在24小时内分屡次给予，这时的急性接触即为“屡次〞。二、急性毒性试验目的1、测定和计算出急性毒性评价参数1927年Trevan引入了半数致死量的概念来评价急性毒性，此后，该指标得到广泛应用，并成为急性毒性的主要指标。2、找出受试物的剂量-效应和剂量-反响关系3、为毒作用机制研究提供线索。急性毒性试验可以得到的毒性参数：①绝对致死剂量或浓度(LD100或LCl00)②半数致死剂量或浓度(LD50或LC50)③最小致死剂量或浓度(MLD，LD01或MLC，LC01)④最大耐受剂量或浓度(MTD，LD0或MTC，LC0)或称为最大非致死剂量(MNLD)⑤急性毒性LOAEL(观察到有害作用的最低剂量)⑥急性毒性NOAEL(未观察到有害作用的剂量)急性毒性的下限参数，非致死性急性毒性作用为终点急性毒性的上限参数以死亡为终点通过病理组织学和中毒病症观察等手段测定三、急性毒性试验设计要点

1、实验动物的选择和要求品种、品系的选择健康状况：健康成年动物小鼠、大鼠测半数致死量，狗观察毒性反响。年龄：大鼠180-240g，小鼠18-25g〔35-50日龄〕，家兔2-2.5kg，豚鼠200-250g，狗10-15kg。性别：雌、雄各半，雌性实验动物要求是未经交配和受孕的。各剂量组动物数：小动物数量为每组10只，大动物也应每组6只。2、剂量设计与分组根据受试物或其近似物的物理、化学性质选择与本实验相同动物物种或品系，相同染毒途径的LD50值作为参考值，选择剂量系列。一般分四组：高中低三个剂量组及一个阴性对照组3、确定实验动物染毒方法：灌胃4、观察周期及观察内容

观察周期：一般为14天或24h，但计算出LD50时应注明急性毒性试验的观察内容〔P132〕中毒出现的时间和病症死亡时间及死亡数→计算LD50剖检、生化及病理学检查毒代动力学分析啮齿类动物急性毒性试验主要的观察工程器官系统观察项目或中毒后的一般表现中枢神经系统和躯体系统行为：姿态改变、叫声异常。不安、活动增多或少动动作：痉挛、震颤、运动失调、麻痹、惊厥、强制性动作刺激反应：易兴奋，对外界刺激反应过敏或迟钝肌肉张力：强直，迟缓血液循环系统心动过速或过缓、心律不齐、血管收缩或舒张呼吸系统呼吸深缓、呼吸过速、喘息、张口和腹式呼吸胃肠系统恶心、呕吐、腹泻；便血、尿血、大小便失禁，便秘；粪便不成型，呈黑色或灰色生殖泌尿系统阴户、乳腺膨胀、分泌物增多；阴茎突出、遗精；会阴部污秽有分泌物眼瞳孔放大或缩小，瞳孔对光反射；流泪，上眼脸下垂；眼球突出、充血，眼球震颤；角膜浑浊皮肤和被毛出现红斑、皮疹、水肿、坏死、脱毛、竖毛、松驰粘膜结膜或口腔中分泌物增多，充血、苍白、黄疸其它直肠或脚爪部皮肤温度降低或升高；姿势异常，消瘦等5、LD50的计算方法：

〔1〕改进寇氏法P127改进寇氏法：计算简便，结果可靠。试验设计要求：组内动物数相等、组间剂量等比例设计、死亡率正态分布、最低剂量组死亡率<20%，最大剂量组死亡率>80%计算公式：logLD50=Xκ-i(Σp-0.5)Xκ--最高剂量组对数值i--组距〔相邻两组剂量对数值之差〕Σp--死亡率总和〔2〕霍恩法优点：简单易行，使用动物少缺点：可信范围大，不够精确特点：每组动物数是固定的，每组4只或5只剂量是固定的，有两种系列：……10，21.5，46.4，100，215，464，1000…………10，31.6，100，316，1000，3160，……即每个剂量组之间的剂量差距只能是2.15倍或3.16倍应用程序：①确定每组动物数，一般大小鼠5只，家兔4只②确定剂量系列，常用的系列为：1.00×10t(t=0、±1、±2)2.15×10t4.64×10t10.0×10t③预试验：如采用10，100，1000mg/kg的剂量↓↓↓LD50可能在100-1000mg/kg不见死亡全部死亡④正式试验：选择100，215，464，1000mg/kg〔t=2〕四个剂量组观察并记录死亡数、死亡时间及中毒病症等。如死亡数为1，1，3，4⑤查表：根据动物死亡数查表〔P366〕求得LD50LD50＝2.78×102＝278〔125-619〕mg/kg四、急性毒性的分级与评价〔P134〕急性毒性评价的最主要的依据就是LD50

急性毒性评价剂量达10g/kg体重以上，仍不引起死亡→认为该受试物的急性毒性试验是平安的急性毒性LD50或7天在喂养试验的最小有作用剂量小于人的可能摄入量的10倍→外表该受试物急性毒性较大，应予以放弃，不再继续试验急性毒性LD50大于人可能摄入量的10倍→该受试物可进入下一阶段的试验急性毒性LD50在人可能摄入量的10倍左右→重复试验LD50虽然是评价急性毒性的最重要指标，但仅凭LD50进行急性毒性评价是不完善的。因为仅仅LD50一个指标只能反映急性毒性的大小，并不能反映毒性的其他特征。因此，在评价和报告化学物急性毒性时，除LD50外，还应报告LD5095%可信限范围、急性毒作用带等指标，并尽可能详尽描述中毒特征、病症表现、出现时间、死亡前兆、毒性作用的发生、开展、恢复经过，以及体重、剖检和病理学变化等。从而较全面地对急性毒性做出评价。免费茶水的重金属严重超标

一份外国学者的研究指出，

中国13个品牌的香烟重金属含量超标第二节蓄积毒性一、根本概念P138当化学毒物连续、反复进入机体，而且进入的速度〔或总量〕超过代谢转化与排出的速度〔或总量〕时，物质就有可能在体内逐渐增加并贮留的现象--蓄积作用〔accumulation〕化学毒物容易蓄积的组织和器官——贮存库

蓄积作用物质蓄积〔materialaccumulation〕：指机体少量反复屡次接触毒物后，该毒物在机体内逐渐积累。功能蓄积〔functionalaccumulation〕：指机体少量反复屡次接触毒物后，每次引起的轻微功能损害逐渐积累，当积累到一定程度时出现毒性效应。蓄积作用的毒理学意义：发生慢性中毒的物质根底评价该毒物能否引起慢性中毒的依据之一制订卫生标准时选择平安系数的主要依据

如：有机氯农药DDT和六六六、重金属铅的危害主要是它们的蓄积作用所造成的慢性毒性。

二、蓄积毒性试验方法

蓄积系数法生物半减期法蓄积系数法蓄积系数是指屡次染毒使半数动物出现效应〔或死亡〕的蓄积剂量[ED50(n)]与一次染毒使半数动物出现相同效应〔或死亡〕的剂量[ED50(l)]的比值。K=ED50(n)/ED50(1)〔以出现生物效应或特异性损伤为指标〕或K=LD50(n)/LD50(1)〔以死亡为指标〕n―屡次接触受试物时产生预期效应的蓄积剂量的总和1―一次接触该物质产生相同效应的一次剂量蓄积系数K蓄积毒性分级K＜1高度蓄积1≤K＜3明显蓄积3≤K＜5中等蓄积K≥5轻度蓄积蓄积系数分级标准：

K=ED50(n)/ED50(1)或K=LD50(n)/LD50(1)

蓄积系数法常用的实验方案：固定剂量法剂量递增法剂量固定的20天蓄积法试验方法分组染毒时间

剂量（LD50）染毒终止观察期固定剂量法2-4组（含对照组）雌雄各半每日一次同一时间1/20∼1/5染毒剂量累计达到5个LD50剂量25∼100天剂量递增法实验组对照组

同上4天为一期见表实验组累积半数死亡或21天结束

21天20天蓄积法随机分5组（含对照组）雌雄各半

每日一次同一时间连续20天

对照1/201/101/51/220天20∼27天剂量递增法使用剂量表：接触天数（天）1～45～89～1213～1617～2021～2425～28每日接触剂量（LD50）0.100.150.220.340.500.751.124日接触总剂量（LD50）0.400.600.901.362.003.004.48累积接触总剂量（LD50）0.401.001.903.265.268.2612.74蓄积毒性试验的目的：求出外源化学物的蓄积系数，了解蓄积毒性大小为慢性毒性试验和其它有关毒性试验的剂量选择提供参考依据为制定有毒物质在食品中的卫生限量标准时，为平安系数的选择提供参考确定该受试物可否用于食品供人类长期食用三、机体的耐受性

机体对化学物的耐受性：一些化学物在体内蓄积到应该产生中毒反映的剂量时却没有出现中毒反响，必须再加大剂量才能出现预期的中毒反响的现象。机体对化学物的蓄积和耐受往往是同时存在的！农药、兽药残留！第三节亚慢性毒性作用一、根本概念定义：亚慢性毒性是指实验动物连续多日接触较大剂量的外源化学物所出现的中毒效应。较大剂量----没有明确的剂量范围下限但剂量上限<急性LD50。较长时间----通常为3～6个月，由试验的目的而定。

亚慢性毒性试验目的：

主要是为慢性毒性试验做准备！1、确定其观察到有害作用的最低剂量〔LOAEL〕和未观察到有害作用的剂量〔NOAEL〕，初步提出这种受试物的平安限量参考数值。2、确定受试物亚慢性毒性的效应谱，毒作用特点和靶器官。3、研究受试物亚慢性毒性损害的可逆性。4、为慢性毒性试验的剂量设计及观察指标选择提供依据。5、为在其它试验中发现的或未发现的毒作用提供新的信息，比较不同动物物种毒效应的差异，为受试物毒作用机制研究和将研究结果外推到人提供依据。二、亚慢性毒性试验设计的要点〔一〕试验动物的选择1、物种品系：啮齿类、非啮齿类2、性别：雌雄各半3、年龄/体重：断乳不久的动物如大鼠80～100g〔21-23日龄〕，小鼠15g左右〔18-21日龄〕4、动物数：大小鼠每组≥20只，犬猴每组≥6只；5、环境要求：应使用SPF及以上等级动物；符合国家实验动物标准的实验环境。〔二〕染毒方式一般采用经口、经呼吸道、经皮肤染毒经口染毒多采用掺入饲料法两个根本原那么：尽量模拟人类在环境中接触该化学物的途径或方式；应与预期进行慢性毒性试验的接触途径相一致。〔三〕剂量分组至少设四组：3个剂量组和1个阴性对照组高剂量组以急性毒性试验的阈剂量或以LD50为参考应能引起明显的毒性或少量动物死亡〔<10%〕中剂量组相当于观察到有害作用的最低剂量〔LOAEL〕低剂量组应无中毒反响，相当于未观察到有害作用剂量〔NOAEL〕，可依据急性毒性的阈剂量或急性LD50的1/20～1/5确定〔四〕观察指标1．一般性指标：〔1〕外观体征、行为活动：每日观察、记录〔2〕体重：一般每周称重一次〔3〕饲料消耗量：每周记录，计算食物利用率食物利用率是指动物每食入100g饲料所增长的体重克数。〔4〕异常表现、中毒病症2．实验室检查：血象检查、尿液；肝、肾功能的检测3．病理解剖学和组织学检查4．其他指标观察指标三、亚慢性毒性作用的评价亚慢性毒性无作用剂量〔NOAEL〕≤人的可能摄入量的100倍，表示毒性很强，放弃该化学物的使用；在100～300倍之间的，可进行慢性毒性试验如≥300倍的不必进行慢性毒性试验，可直接进行毒性评价第四节慢性毒性作用及其试验一、根本概念慢性毒性是指实验动物长期小剂量反复接触受试物所引起的毒性效应。长期：小鼠一般为18个月〔