猴鼻腔组织病理学检查方法学探讨

猴鼻腔组织病理学检查方法学探讨

近年来的研究表明，一些抗高血压、镇痛剂、抗生素和抗高血压药物通过鼻粘膜吸收，比口服更有效。很难从鼻腔吸收的多肽和蛋白质类药物,当选用合适的黏膜促透剂或制成生物降解性微球等新剂型给药时,能提高鼻腔吸收的生物利用度［1］。石蜡制片是毒性病理学中常用的技术,在国内外药物非临床安全性评价的病理学研究中仍是主要的技术手段［2］,石蜡制片质量直接影响病理学家对药物毒性的评价,国内对于非人灵长类鼻腔的一致性病理制片方法还没有相关报道。本文以食蟹猴为例,从鼻腔的解剖、固定、脱钙液的选择、4个切面的取材等方面对猴鼻腔制片的多个环节进行探讨,以期快速地获得符合毒性病理学镜检要求的一致性猴鼻腔HE染色切片,并对各切面的不同鼻粘膜上皮类型进行了简要描述。1材料和试剂1.1实验动物食蟹猴,2~3岁,普通级,体重2~3kg,购自海南新正源生物科技有限公司[合格证号:SCXK(琼)2011-0002]。1.2主要试剂苏木精、醇溶伊红购自武藤化学公司,58℃-60℃高温石蜡购自徕卡公司,二甲苯、乙醇、氯仿、甲酸、甲醛等购自北京化学试剂公司。1.3主要仪器Tissue-TekVIP6全封闭组织脱水机,TCEMJ-2型自动包埋机,IVS-410滑动式切片机,石蜡切片伸展器,PS-125WH型水浴锅,石蜡熔融炉(SAKURA公司),电锯(史塞克公司)。2猴鼻发育小鼠鼻牙的制备工艺2.1解剖和固定食蟹猴静脉注射3.5%的戊巴比妥钠进行麻醉(麻醉剂量为35mg·kg－1),待麻醉后,从股动脉放血至可视粘膜苍白。然后剥开猴头部皮肤,使颈部弯曲,切断头后部肌肉,从枕大孔处剪断颈关节和脊髓。简单剔除左右咬肌后,使用电锯沿额骨、颞骨、枕骨锯开［3］。摘出大脑和垂体后,用电锯将眉弓和下颌骨锯掉,尽量剔除多余的肌肉,将摘取的鼻腔用10mL注射器从两侧鼻孔缓慢注入3mL左右10%中性缓冲福尔马林液,以排出鼻腔内存留空气以免影响鼻腔内组织的及时固定,然后及时将鼻腔放入10%中性缓冲福尔马林液中固定5~7d。2.2脱钙把固定好的鼻腔用氯仿、酒精等量混合液浸泡6~10h。然后使用无水乙醇作用30min,更换新的无水乙醇作用30min,作用完倒掉无水乙醇水洗20min以上,移至脱钙液。脱钙液为JYBL-Ⅲ50%甲酸脱钙液［4］。脱钙液的配制方法:甲酸50mL,甲醛10mL,蒸馏水40mL。将配好的脱钙液放入适当大小的容器(根据组织体积判断)内,将水洗充分的鼻腔组织块浸入脱钙液中,组织和脱钙液的比例一般为1∶15~20。通常食蟹猴鼻腔的脱钙需要4~6d。2.3取材将脱钙完全的鼻腔组织从脱钙液中取出,直接流水冲洗至少8h,将水洗后鼻腔组织移至取材台进行取材。以牙齿为标志物通过鼻腔横截面(垂直于硬腭)进行切取,采用国际通用的针对鼻腔吸入毒性试验的取材方法,需要垂直于硬腭取4个面。第1个切面在第1前磨牙前(图1-A、2-A、3-A);第2个切面在第1、第2前磨牙之间(图1-B、2-B、3-B);第3个切面在第1磨牙后包括鼻腔旁边的上颌窦(图1-C、2-C、3-C);第4个切面在鼻咽部软腭的前端和后端中间的位置(图1-D、2-D、3-D)［5－6］。2.4脱水取材结束后进行脱水。猴鼻腔脱水程序如下:70%乙醇1.5h2次,80%乙醇1.5h2次,95%乙醇1h2次,100%乙醇0.5h2次,二甲苯0.5h2次,石蜡1h3次(石蜡温度均为58~60℃)。2.5切片、染色脱水结束后石蜡包埋,滑动切片机切片厚度约3~5μm,展片水温度42~44℃,烤片温度44℃,HE染色。3不同部位可显示组织的结构以上所描述的猴鼻腔解剖、固定、脱钙、取材、脱水、包埋和切片方法,是国家药物安全评价监测中心临检与病理室经过长期实践和探索而建立起来的。按上述方法制成的猴鼻腔HE染色切片,表面平整,组织结构清晰、完整,染色对比鲜明,可清晰显示猴鼻腔不同部位包括粘膜上皮和粘膜下组织在内的多种结构(图4),例如第1个切面可显示鳞状上皮、移行上皮及呼吸上皮,以鳞状上皮为主,图4-A所示鳞状上皮较厚,固有层内皮脂腺等结构清晰可辨;第2个切面亦可显示鳞状上皮、移行上皮及呼吸上皮,图4-B所示移行上皮介于鳞状上皮和假复层纤毛柱状上皮之间,与鳞状上皮分界明显,与呼吸上皮分界不明显,猴的移行上皮较厚,4-5层细胞厚度;第3个切面可显示呼吸上皮和嗅上皮,第4个切面可显示呼吸上皮,图4-C~-E所示不同部位呼吸上皮为典型的假复层纤毛柱状上皮;图4-F所示为嗅上皮,由嗅觉感觉神经元、支持细胞和基底细胞组成,嗅上皮还有少量的微绒毛细胞和鲍曼氏腺。4主要操作要点非人灵长类猴鼻腔的毒性病理检查一致性切片方法在国内还没有相关报道,由于猴鼻腔组织成分复杂,包括皮肤、肌肉、腺体、脂肪、结缔组织和骨组织,进行脱钙时需要面对酸类对其他组织的破坏作用,因此猴鼻腔对脱钙的要求很高,不仅要将骨脱好钙,还要尽可能降低对其他组织的破坏。脱钙液的选择以及脱钙后组织的除酸,直接关系到病理切片的质量。对于猴鼻腔脱钙来说,甲酸是较为理想的脱钙液,它的优点在于脱钙迅速、效果较佳,更重要的是它对鼻粘膜组织的损害比较小,对染色影响不大。甲酸在低浓度时是很好的脱钙液,一般浓度不超过20%,当浓度达到50%时,其脱钙的效果是最理想的。但要注意,浓度的加大确实加快了脱钙的速度,但对组织的影响也有所加大,当然比其他无机酸的破坏作用还是较低的。猴鼻腔组织脱钙后的充分除酸是保证染色不受影响的前提,目前常用的除酸方法包括:(1)使用碱处理;(2)使用70%乙醇处理;(3)流水冲洗。经过长时间实践作者认为在把握好冲洗时间的前提下,流水冲洗简单易行是较好的除酸方法。另外,更换固定液、脱脂液和脱钙液的时候要注意,使用镊子轻轻晃动猴鼻腔见有气泡从鼻孔处出来后停止,或者使用10mL注射器伸入固定液、脱脂液和脱钙液中把猴鼻腔中的空气抽出,以免影响鼻腔内部的脱脂和脱钙。除上述因素外,石蜡的选择,切片展片的水温、染色偏色的控制等因素对制片亦有很重要的影响［7］。通过上述方法制成的猴鼻腔切片,除了可以观察鼻粘膜上皮和皮下组织外,其他一些结构也可以通过这4个切面进行组织病理学评价。比如,鼻泪管、壶腹窦、咬肌及三叉神经等。由于鼻腔给药具有许多其它途径无法比拟的优越性,通过选择合适的药物剂型,可使鼻粘膜在较长时间内保持高药物浓度,可加速药物透过鼻黏膜吸收,提高药物的生物利用度。一些目前只能通过注射或口服途径给予的药物,如胰岛素、蛋白质、核酸、多糖等,将出现鼻腔给药新剂型,以减轻副作用,提高疗效,方便使用,更好地为人类健康服务。本文介绍的非人灵长类鼻腔一致性切片制片方法,可以显示出鼻腔不同种类的上皮及其周围组织,为这类新型鼻腔给药药物的毒性病理学评价奠定了基础。随着对鼻腔生理结构及治疗疾病机理的深入研究,人们发现通过鼻腔给药不但可以治疗局部鼻腔疾病,还可以用于一些突发状况和救急,例如急痛和心脏病突发等,鼻腔给药还可以用于一些慢性病,如糖尿病、生长功能障碍等［8］。在标准化体系下全面的鼻腔检查对于吸入途径及其他途径给药而言也具有非常重要的意义。目前,吸入途径给药实验引起呼吸道病变的报道很多,但是非吸入途径给药实验呼吸道组织的病变,尤其是上呼吸道的病变经常会遗漏。通过常规详细检查上呼吸道,尤其是鼻腔,上呼吸道病变的检出率比预期高很多。通常,肿瘤性病变常常位于鼻腔的前部及中部,而非肿瘤性病变发生于嗅上皮。鼻非肿瘤性病变包括:呼吸上皮增生,嗅上皮变性、坏死和萎缩,嗅上皮化生为呼吸上皮,以及新生成的呼吸上皮的增生。鼻肿瘤包括:腺瘤、腺癌、鳞状细胞癌和神经母细胞瘤等［9］。呼吸上皮增生常见鼻中隔、鼻甲和腹侧筛窦鼻甲［10］。鳞状细胞癌,更常出现在鳞状上皮化生的呼吸、移行或嗅上皮区域［11］。血管内皮瘤虽然