濒危植物mikef-1a基因片段的克隆与序列分析

濒危植物mikef-1a基因片段的克隆与序列分析

实时荧光定量pcr是近年来开发的一种新方法。它已被应用于随组研究、碳代谢和抗应力等相关基因的发现和分析。在应用实时荧光定量PCR检测基因的表达量中,必须选择合适的内参基因进行校正和标准化。内参基因在PCR扩增中的变化可以反映RNA数量、质量和cDNA合成效率的变化。eEF-1a(编码Eukaryoticelongationfactor1-alpha)在植物组织中表达相对稳定,可以作为实时荧光定量PCR研究植物基因表达分析中的看家基因。独行菜(LepidiumapetalumWilld.)属于十字花科独行菜属植物,分布广泛,我国南北各省均有分布,多生于路旁,荒地,屋旁及田间。生活在新疆北部的独行菜属于比较典型的早春短命植物类型,能在早春萌发,其萌发过程必然会常常受到低温的胁迫。因此研究独行菜萌发过程及生长周期低温胁迫基因差异表达,对揭示植物短命机制、萌发低温耐受机制等有重要的意义。目前还没有独行菜有关看家基因的研究尚未见报道。鉴于此,本研究以独行菜幼苗为材料,采用RT-PCR方法克隆独行菜eEF-1a基因片段,并对其在独行菜中的表达稳定性作初步分析,为研究其它基因在独行菜的表达和调控选择内标参照奠定基础。1材料和方法1.1材料表面1.1.1植物叶片rna的提取独行菜(LepidiumapetalumWilld)种子采自乌鲁木齐鲤鱼山。独行菜幼苗提取总RNA。菌株为E.colDH5α(实验室保存),质粒为pMD18-TVector(Takara)。1.1.2生化试剂和生化试剂Trizol总RNA抽提试剂盒、MMLV第一链cDNA合成试剂盒、PCR产物克隆试剂盒等均购自宝生物公司,DNA胶回收试剂盒、DNAmarker购自东盛生物试剂公司,PCR扩增试剂盒购自北京天根,其他生化试剂均为进口或国产分析纯。1.2方法1.2.1总ra的提取用Trizol从独行菜15天龄幼苗中提取总RNA。用紫外分光高度法和琼脂糖凝胶检测纯度和完整性。1.2.2pcr扩增及回收纯化通过对已发表的植物eEF-1a基因的核苷酸序列设计一对引物AL、AR,用于扩增独行菜eEF-1a基因片段,推测目的片段的长度为570bp。引物为AL:CACCAATCTTGTACACATCC,AR:GACCACCAAGTACTACTGCAC;嵌套PCR检测引物为:ef1-f:CAAGGCTAGGTACGAT,ef1-r:CAATCATGTTGTCTCCCT。引物均由华大基因合成。取2μg独行菜总RNA,按照第一链cDNA合成试剂盒(Takara)说明合成第一链cDNA。PCR扩增反应体系:10×PCRBuffer5μl,25mmoll-1MgCl23μl,2mmoll-1dNTP5μl,10moll-1AL1μl,10moll-1AR1μl,TaqDNApolymerase(5Uμl-1)0.5μl,cDNA2μl,加水至50μl。反应条件:94℃预变性2min;94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸45s,30个循环;最后72℃延伸10min。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶检测,回收纯化按照柱式胶回收试剂盒操作说明进行。扩增片段回收后作为模板进行嵌套PCR检测,嵌套PCR反应体系和条件与上述PCR扩增基本一致,其中退火温度降至52℃。1.2.3质粒pcr扩增将嵌套PCR检测为阳性的PCR产物连接到pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌,用含有50μgml氨苄青霉素的LB固体培养基进行蓝白斑筛选,阳性克隆经质粒PCR鉴定确认后,送至华大基因测序。1.2.4序列同源性分析1.2.5基于cdna一链的rt-pcr分析取独行菜萌发过程子叶将要展开时的种子、三叶期幼苗、花期叶片、及上述三个时期对应材料经4℃处理12小时,用Trizol提取总RNA,用紫外光吸收法调整各总RNA的浓度,尽量保持一致,取尽可能相同量的总RNA进行RT-PCR分析。cDNA一链合成按1.2.2进行。取0.5μl一链产物为模板进行PCR扩增,25μl体系包括1×PCRBuffer,0.2mmol·L-1dNTPs,1.5mmol·L-1MgCl2,上下游引物ef1-f、ef1-r:各0.4μmol·L-1,1UTaqDNA聚合酶。温度循环参数为94℃预变性5min;94℃45s,52℃45s,72℃1min,30个循环;72℃延伸5min。产物进行琼脂糖凝胶检测。2结果与分析2.1总rna纯度和完整性检测RNA电泳结果显示(图1),28s和18s条带整齐清晰、亮度约为2:1,分光光度检测OD260/OD280为1.8-2.0;OD280/OD230大于2.0。表明总RNA纯度和完整性都比较高。可以用于RT-PCR扩增及分析实验。2.2eef-a基因片段以总RNA反转录所得到的第一链cDNA为模板,用AL、AR引物(见材料与方法)进行PCR扩增。扩增产物经凝胶电泳检测发现约在570bp处有一条亮带,且上下无杂带,与预期目的片段的大小一致(图2),推测可能是eEF-1a基因片断。进一步进行嵌套PCR检测,得到条带清晰、大小符合预期的产物(如图2),推断该PCR产物为目标产物,可进一步克隆测序。2.3pcr扩增培养将回收纯化的目的片段连接到pMD18-T克隆载体上,转化E.coli.DH5α。从转化的平板上随机挑取一个单菌落进行摇菌、提取质粒、进行PCR扩增。得到的扩增片段大小约为570bp(图2),与RT-PCR结果一致,表明这些克隆为阳性克隆,可以进行测序。2.4eef-aa基因片段的分析将重组pMD18-T质粒进行测序,得到一段长度为570bp的序列。序列如下:AGACCACCAAGTACTACTGCACAGTCATTGATGCACCTGGACATCGTGATTTCATCAAGAACATGATTACTGGTACCTCCCAGGCTGATTGTGCTGTCCTTATCATTGACTCCACCACTGGTGGTTTTGAAGCTGGTATCTCCAAGGATGGTCAGACCCGTGAGCACGCTCTTCTTGCTTTCACCCTTGGTGTCAAGCAAATGATTTGCTGCTGTAACAAGGTGAGCTAGTTCCTTAAGTTATCTTTTTTTTTGTAATTTTTTAATAGTCTAAAGCTAATTTTTTTTTCTTTCAGATGGATGCCACTACCCCCAAATACTCCAAGGCTAGGTACGATGAAATCATCAAGGAGGTTGCCTCATACCTGAAGAAGGTCGGATACAATCCTGACAAAATCCCATTCGTGCCCATCTCTGGATTTGAGGGAGACAACATGATTGAGAGGTCCACCAACCTTGACTGGTACAAGGGACCAACTCTCCTTGAGGCTCTTGACCAGATCAATGAGCCCAAGAGGCCATCAGACAAGCCCCTCCGTCTTCCACTTCAGGATGTGTACAAGATTGGTGGBlast比较结果显示:该序列与拟南芥的eEF-1a基因核苷酸序列的同源性达到95%,表明所克隆到的片段为eEF-1a基因片段。2.5冷处理前后eef-aa基因表达变化提取不同时期独行菜的总RNA,以及对应时期冷处理材料的总RNA进行RT-PCR分析,结果如图3所示,eEF-1a基因在选择的三个生长阶段及对应的冷处理后均有较高水平的表达,并且各时期间没有明显的差异说明eEF-1a基因在独行菜各生长阶段和冷处理后基因表达基本稳定,能够作为其他基因定量表达分析的内标基因。3eef1a基因真核生物延伸因子可分为eEF1和eEF2,eEF1介导氨酰-tRNA与核糖体结合,它有4个亚基,分别为EF-1α、EF-β1、EF-1β和EF-1γ,1995年4月IUBMB委员会将其重新命名为分别为eEF1A、eEF1Bα、eEF1Bβ和eEF1Bγ,eEF1A相当于原核生物的EFTu,为量甚多,仅次于肌动蛋白,广泛存在于真核细胞内,是在核糖体上催化氨基酸链的延伸而推动、控制蛋白质的合成等方面起到重要作用的蛋白质因子。在植物蛋白质合成延伸过程中,eEF1A是一个主要的翻译因子;在快速增殖的细胞中,eEF1A基因的表达调控十分保守,其表达水平同细胞生长及增殖速度有关。除了参与同翻译控制有关的信号传导外,eEF1A还参与细胞生长、应激反应及与运动性有关的信号传导。目前许多植物的eEF1A基因已被分离,植物种间的氨基酸序列高度保守[10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20];植物eEF1A由多基因编码,但它的表达相对稳定性可作为一种新颖的分子进行遗传和生理标记。生活在新疆北部的独行菜作为一种典型的早