脱毒芋茎尖培养及产量表现

脱毒芋茎尖培养及产量表现

植物病毒病是影响作物产量和品质的重要疾病之一。大多数植物都受到不同程度的病毒疾病的影响，尤其是营养繁殖的严重植物。芋(ColocasiaesculentaSchott)是世界各地广为栽培的蔬菜和粮食作物。在我国芋栽培历史悠久,优良品种甚多,其中一些已成为出口创汇的拳头产品,如福建福鼎芋、莱阳蚬河芋、广西荔浦芋等。随着改革开放和人民生活水平的提高,芋的市场需求大大增加,特别是沿海地区芋及其加工品出口量迅速增加,为芋头生产的发展开拓了广阔前景。但在长期利用球茎进行营养繁殖过程中,携带病毒的种芋直接将病毒传给子代,并通过蚜虫等介体在株间传播,导致栽培芋已普遍受病毒侵染,造成品质劣变、产量降低。目前报道的芋病毒中分布最广、危害最大的是芋花叶病毒(Dasheenmosaicvirus,DMV),感染这种病毒的植株的球茎大小、数目和品质都会明显下降,产量损失接近60%。因此,采用组织培养技术对现有优秀品种进行脱病毒研究很有必要。试验对莱阳孤芋茎尖培养脱毒技术及脱毒后的产量变化进行研究,以便为芋脱毒技术的进一步应用奠定基础。1材料和方法1.1tptp品种供试芋(ColocasiaesculentaSchott)品种为莱阳孤芋。将顶芽饱满的球茎剥去外周鳞片,自来水冲洗后,切取0.5cm×0.5cm×1.0cm的带顶芽芋块进行表面灭菌,以获得无菌外植体。1.2温度和光照将经表面灭菌的带芽小芋块,在解剖镜下剥取0.2～1.0mm大小的茎尖,接种于培养基上,置温度白天(27±2)℃、夜间(20±2)℃、光照强度1500～2000lx、每天照光12h条件下培养,注意观察茎尖生长、分化情况。为了提高脱病毒效果,选剥离较小的茎尖(小于0.5mm)得到的试管苗再次剥取小于0.5mm的茎尖,于培养基中诱导芽分化,如此连续进行2次。1.3蛋白免疫活性测定病毒检测在农业部植检所进行,选经3次剥离茎尖培养获得的试管苗为材料,采用酶联免疫检测和电镜观察两种方法。酶联检测采用SPA-ELISA方法,芋花叶病毒抗血清购自美国Agdia公司。第1抗体及第2抗体的稀释度为1/100和1/200。检测样品及阴性对照用抗原缓冲液稀释成两个浓度,即1/20和1/40,进行实际检测。A蛋白酶标抗体购自上海生物制品研究所,工作浓度为1/40;反应结束后测定492nm下的OD值。电镜观察采用直接沾取和免疫诱捕法制备样品在透射电镜下观察病毒形态。1.4种子栽植、脱毒对经病毒检测证明已脱去病毒的株系进行组培快繁。当试管苗高3cm以上、生根3～5条时,开瓶炼苗1周后在温室内进行移栽。成活后,待小苗具4～5片叶时即可出圃。每年春季将脱毒试管苗定植于网室,秋季得脱毒原原种芋;脱毒原原种芋在隔离条件下种植(1km内无天南星科植物种植),得脱毒原种芋。1.5种植筛选试验2000和2001年将脱毒原原种芋、脱毒原种芋和对照(未脱毒)按随机区组设计进行比较试验,选择脱毒芋和对照大小相近的球茎作种芋,小区面积24m2(长5m×宽4.8m),行距80cm、株距25cm,重复3次。收获时每小区随机选取18株作单株调查,单位面积产量以小区实际测产为准。2盐藻叶片的分离和鉴定将剥取的茎尖转接到适宜培养基上,5d后变绿并开始生长,说明已经成活。茎尖成活率与其大小有关,试验表明,茎尖在不大于0.3mm时,较难成活;在大于0.6mm时,成活率达100%;在0.3～0.5mm时,成活率80%以上(表1)。成活的茎尖经40d的培养,可分化形成不定芽,其分化率与培养基中生长调节剂的配比及精胺(Spm)的浓度有关(表2)。对表2结果的进一步分析发现,BA,NAA和Spm的最优水平分别是1.0mg/L,0.2mg/L和20mg/L,即适宜于芋茎尖芽分化的最佳培养基为:MS+BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+Spm20mg/L。在该培养基上的进一步茎尖培养发现,其分化率均在98%以上。酶联检测的结果列于表3,其中S1-5为样品,P、N分别代表阳性和阴性对照。表3数据显示,阳性对照OD值大于健康植株阴性对照值两倍以上,且不同处理的样品检测结果一致,说明处理方法对检测结果影响不大,本次酶联反应正确,试验结果比较可靠。按照酶联检测的结果判断原则,所测定样品的OD值小于阳性对照值两倍,因此,所测定的样品与芋花叶病毒血清的抗原抗体反应被判为阴性。电镜观察的结果也显示,在芋茎尖组培苗的所有测定样品中,未见明晰的病毒粒体;而在对照样品及阳性对照中,观察到了不同的病毒粒体。由酶联检测和电镜观察结果可以证明经3次茎尖培养脱毒处理,这些芋组培苗脱毒效果比较理想,已成为脱毒苗。2.3脱病毒对生产对芋球茎的影响将已生根的试管苗取出,洗净培养基后移栽于温室苗床中,保温保湿培养1周,试管苗即可恢复生长。1个月左右可长出4～5片叶,此时可出圃定植于防蚜网室内,当年秋季收获的芋球茎即为脱毒原原种,脱毒原原种第2年种植所得芋球茎为脱毒原种。对脱毒芋和未脱毒芋(对照)后代球茎数量的统计结果表明,脱病毒后芋球茎数量明显增加(表4)。其中,试管苗所形成的球茎数量最多,达每株31.2个,显示出巨大的增产潜力;脱毒原原种、原种所形成球茎数量也达到每株24.8～27.6个,较对照高出37.0%～52.5%。可见,脱病毒能显著增加后代芋球茎的数量。脱病毒处理的主要作用之一是增加产量。通过对脱毒莱阳孤芋与对照的两年田间试验结果的比较发现,脱病毒可使莱阳孤芋的单位面积产量较对照增加20.2%～43.9%(表5)。从表5可见,除脱毒试管苗的子芋重明显较高外,脱毒原原种、原种的后代芋球茎中,子芋重和母芋重与对照差异不大,而孙芋重却比对照增加51.8%～107.5%,因此,孙芋重的极显著增加是脱毒芋增产的主要因素。此外,脱毒芋的商品芋产量也显著高于对照,其中,脱毒原原种、原种的商品芋产量较对照增加49.9%～70.0%,明显高于其单株总产的增加幅度(单株产量较对照增加28.4%～42.8%),说明脱病毒不仅能增加产量,还能提高大球茎的比例,从而大大提高其经济价值。3对种病毒的检测从本试验的结果可见,脱毒芋试管苗直接栽培所结球茎较小、商品芋产量也较低(表4,5),但球茎数量多,从而使其产量较以球茎作种芋的未脱毒芋还提高9.2%。而脱毒原原种在球茎个数、商品芋数量和产量等指标上均较对照有极显著增加,脱毒原种也有类似效果。但是脱毒芋的增产潜力可保持多少代、栽培上应怎样充分发挥脱毒芋的增产潜力等问题还有待于进一步研究。另外,通过茎尖培养获得的“脱毒苗”或“无毒苗”,只是通过鉴定不带某种或某些病毒,事实上,植物常受到多种病毒的侵染,而且可能还带有某些未知病毒,实际工作中不可能对所有病毒都进行检测。本试验也仅对严重影响芋头生产、且侵染普遍的芋花叶病毒进行了检测。而目前已鉴定的感染芋的病毒,除芋花叶病毒外,还有香蕉束顶病毒(bananabunchytopvirus),芋杆状病毒(tarobacilliformvirus),芋瘦小病毒(colocasiabobonediseasevirus)和芋叶脉缺绿病毒(taroveinchlorosisvirus)等,因此,对我国芋主产区栽培芋进行全面的调查与检测,明确我国芋感染病毒的种类及特点,建立无病毒种源供应体系,这不仅能使我国很多良种芋的宝贵资源得到保持和发展,还将对我国芋头生产产生巨大的推动作用。2.1领导人的