sds-pb法分离胶的制备及应用

sds-pb法分离胶的制备及应用

1小分子多肽的测定方法sds？专栏（十二烷基硫酸钠）的大分子量测定技术最早由shapilo等人在20世纪60年代建立，然后由weber等人改进。多年来,它一直被用来测定分子量在数万至十几万的大分子蛋白质,可见到较多的相关研究报道。目前,它已是生化工作者常用的分析技术之一。近年来,对小分子多肽的分子量测定有所要求,而用电泳法测定分子量在几千的小分子多肽的研究报道则甚少,从情报检索可知国内尚处于摸索阶段。作为《食用丝素产品的研究与开发》国家项目中的一个专题,我们于1999年涉足生化测定技术领域,运用国产电泳仪器,用改进后的SDS?PAGE技术,清晰地分离出了一组分子量在2500~17000范围的小分子多肽的六条色带,制取的标准曲线其线性相关系数r达0.97,并对分子量在几千的小分子肽进行了较为成功的测定。研究结果表明,调高分离胶浓度是用SDS?PAGE法测定小分子多肽分子量获得成功的关键。2材料和方法2.1实验材料2.1.1仪器DYY?Ⅲ4型稳压稳流电泳仪2.1.2样品pharmacia公司出品的低分子量组标准多肽2.1.3样品溶液的配制(1)凝胶储液:丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加水至100mL,过滤备用。(2)分离胶储液:Tris36.3g,1mol/LHCl48mL,加水至100mL,调节pH至8.8~8.9。(3)浓缩胶储液:Tris6.0g,1mol/LHCl48mL,加水至100mL,调节pH至6.7~6.8。(4)电极液储液:Tris6.0g,甘氨酸28.8g,SDS1g,加水至1000mL。(5)10%过硫酸铵:现配现用。(6)TEMED(7)样品溶解液:SDS1g,溴酚蓝少量,浓缩胶储液5mL,加水稀释至25mL。(8)染色液:考马斯亮蓝R2501.25g溶于230mL甲醇中,再加40mL乙酸,最后稀释至500mL。(9)脱色液:乙酸75mL,甲醇50mL,加水稀释至1000mL。2.2方法的一般过程2.2.1制胶:根据预定胶浓度,吸取定量的凝胶储液,依次加入分离胶储液、SDS(10%)、TEMED和水,慢速搅拌(尽量避免空气带入胶中),并在真空干燥器中抽气5min。在加入过硫酸铵后,稍加搅拌即将胶液按一定角度沿玻壁注入垂直板型凝胶模子中。至距上沿约3cm处,加2~3滴饱和正丁醇溶液。按上述程序再配好浓缩胶,待分离胶聚合凝结后,用滤纸吸取胶顶层的饱和正丁醇,注入浓缩胶并嵌入梳形样品模具,凝结后取出模具。2.2.2样品处理:从冷藏箱中取出标准样品和样品溶解液放至室温。向含有样品的试管中加入样品溶解液,振荡使其溶解,盖上软塞在沸水中加热5min,然后冷却至室温。2.2.3电泳:用微量注射器按标号依次向样品槽注加已处理的标准组样品和自制样品20μL,电流为32mA,待溴酚蓝前沿进入分离胶后减至20mA,电泳时间2h。2.2.4小分子多肽的鉴定:小分子多肽区带的鉴定,可采用考马斯亮蓝R250染色法进行。整个过程为固定、染色和脱色。在脱色过程中及时定位拍照。2.2.5测定小分子多肽的电泳迁移率,制作标准曲线并计算被测样品的分子量:用倍率计读出照片上各样品色带中心与溴酚蓝前沿的距离,按标记变化比率换算出实际尺寸进行计算。电泳迁移率为Rf,即:Rf=样品迁移距离溴酚蓝迁移距离样品迁移距离溴酚蓝迁移距离以标准组多肽的迁移率为横坐标,以其对应的分子量对数为纵坐标作图,经线性回归计算,得到标准曲线。然后根据未知样品的迁移率在曲线上查出其对应的分子量。3结果与讨论3.1分离胶孔径的影响分离胶是凝胶电泳系统中的核心部分,起分子筛和载体的作用。分离胶的浓度与交联度直接影响到样品的分离效果。参考大分子蛋白质电泳条件,我们在总浓度分别为10%、12%、15%、18%、20%及25%,交联度为2.6%的系列条件下进行了试验。结果显示:12%浓度的分离胶系统虽然能对6000~14000分子量的小肽起分离作用,有泳斑可见,但是效果很差,分离界限模糊(见图1),而且色斑在脱色时易丢失(图1中3、4、5泳道样),说明分离胶孔径太大;当分离胶浓度提高到15%的时候,系统的分离效果得到改善,可以明显地分离出6000、8000、10000、14000四档分子量的多肽,但是未能分离出2500和17000分子量的肽(见图2中5、6泳道样),分离效果仍不理想;当分离胶浓度提高到20%时,则有非常清晰的六条色带出现(见图3a),这六条色带是pharmacia公司出品的一组低分子量标准肽,分子量分别为2512、6214、8519、10700、14404和16949;当分离胶浓度提高到25%时,则电泳受阻严重,说明分离胶孔径已经太小。由此可见,要分离测定分子量在2000~17000范围的小肽,在交联度为2.6%的条件下,选择近20%的分离胶浓度是非常合适的,可以获得理想的分离效果。3.2线性回归处理从图3(a)我们得到了pharmacia公司出品的低分子量组标准肽的相对迁移率,见表1。由表1数据经线性回归处理得到的标准曲线如图4所示,其线性相关系数r=-0.97。可见,分子量在2500~17000范围的小分子肽在总浓度为20%、交联度为2.6%的分离胶系统中电泳所得到的结果具有很高的可信度,因此该标准曲线可用来查找计算未知样品的分子量。3.3小分子肽的分子量从上海某所购得一小分子肽,经质谱测定得其分子量为5799。从电泳图3泳道5测得该小分子肽的相对迁移率为0.397,从标准曲线上查得其分子量对数为3.725,