蛋白质o-糖基化的研究进展

蛋白质o-糖基化的研究进展

1o-糖基化蛋白的n-糖组学蛋白质的糖基化是糖链通过糖基转移酶而结合到特定氨基酸残基中的一种变化。据估计,细胞中50%以上的蛋白质具有糖基化修饰。糖基化修饰对蛋白质的结构功能起重要的调控作用,与各种生理现象密切相关。蛋白质的糖基化修饰主要有N-糖基化(N-glycosylation)和O-糖基化(O-glycosylation)两种形式。一般所说的蛋白质O-糖基化是指在蛋白质的Ser/Thr上通过“多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶”的催化作用,加N-acetylgalactosamine(GalNAc)起始的黏多糖(mucin)类O-糖基化。另外,还有O-GlcNAc、O-mannose、O-fucose、O-glucose、O-xylose等O-糖基化形式。蛋白质O-GalNAc糖基化有很重要的生物学意义。在神经系统中,O-糖链的core1结构(T抗原)在发育的神经元轴突表面有大量分布,并且在果蝇的神经系统发育过程中起重要的作用。同时,O-糖基化变化也是细胞恶变和肿瘤发展的普遍特征。为探索蛋白质O-糖基化在疾病或生理过程中的作用,需要对O-糖基化蛋白质进行分析:首先确定不同的生理状态中哪些蛋白质发生了O-糖基化修饰,其次确定O-糖基化修饰的位点,并进一步解析O-糖链结构的变化和进行定量分析。然而,O-糖基化蛋白质的分析是比较困难的。高灵敏度高通量的生物质谱(massspectrometry)目前是蛋白质组学分析的核心技术手段,同样也是研究蛋白质糖基化的首选技术手段。研究蛋白质糖基化的蛋白质组学被称作糖蛋白质组学。由于蛋白质糖基化的复杂性,糖蛋白质组学研究技术远不如其他蛋白质翻译后修饰如磷酸化、乙酰化蛋白质组学的研究技术成熟。与核酸和蛋白相比,糖复合物更难分析。这是由糖类的独特性质引起的。构成哺乳动物糖链的主要结构单位是10种单糖。这些单糖之间通过某些羟基相互连接而得到线形或分叉的结构,每种连接在构象上还有α、β的区别,再加上其合成没有模板,导致可能的糖链结构有极多的选择性。质谱虽然功能强大,但在结构分析中只是通过化合物分子量的递减反映出连接位点的组成,因此在对糖链结构的解析上仍有一定的局限。对糖基化蛋白的分析需要结合多种方法进行分析,并借助生物信息学,以期从微量样品中得到最大化的信息。相比蛋白质的N-糖基化分析,O-糖基化分析更加困难和复杂。蛋白质的N-糖基化具有一系列保守特征:(1)经典的N-糖基化发生在蛋白质特征序列NXT/S(其中X是除脯氨酸之外的任意氨基酸)的天冬酰胺上,其修饰目标序列具有保守性;(2)具有相同的五糖核心结构;(3)具有从蛋白质上游离N-糖链的通用糖苷内切酶,例如PNGaseF与EndoH。PNGaseF可以从天冬酰胺上整体解离糖链,同时将天冬酰胺转变为天冬氨酸。EndoH则切割N-糖蛋白糖链的di-N-acetylchitobiose(GlcNAcGlcNAc)部分,将N-糖链整体游离。这些保守特性都为蛋白质的N-糖基化分析提供了便利。相比之下,O-糖基化发生在蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上,首先,没有特征修饰序列可做修饰位点预测;其次,O-糖基化的糖链结构比较复杂,至少存在4种核心结构(图1);第三,对于O-糖基化蛋白质来说,尚未发现可以将O-糖链整体从肽链上游离的通用内切酶,需要采用其他的化学手段使O-糖链从多肽上游离。对复杂生物体系蛋白质的O-糖基化的分析,首先,要从生物体系分离或富集O-糖基化的蛋白质(或多肽);其次,在得到了O-糖基化蛋白质或多肽后,需要进行蛋白质的酶解、糖链与蛋白解离、电泳/色谱分级、衍生等预处理;最后,进行质谱和串级质谱分析,得到定性定量的结构信息。近年在这些方面涌现了较多关于O-糖基化分析的新技术和新方法。2糖基化蛋白质与多媒体化蛋白的分离和富有成效2.1凝集素的种类凝集素是一类具有糖型选择性的糖亲合性蛋白。利用凝集素富集糖蛋白或糖肽是常用的技术手段。在众多的凝集素中,木菠萝凝集素(Jacalin)、VVA-B4(Viciavillosaagglutinin-B4)、蜗牛凝集素(HPA)、花生凝集素(PNA)是常用于O-糖基化蛋白质富集的凝集素,其中最常用的是Jacalin。Jacalin能结合O-糖蛋白,但也能与高甘露糖型N-糖蛋白结合。Narimatsu等验证了Jacalin和Tn、core1、core3和ST等O-糖核心结构的亲合力,但发现Jacalin对core2、core6和STn结构的O-糖不能结合。Regnier等在Jacalin富集前先用ConA凝集素将干扰的N-糖基化蛋白质去除,再用Jacalin富集O-糖基化的肽段。Medzihradszky等为了在富集O-糖肽的过程中提高特异性,先在蛋白质的层次上用Jacalin富集O-糖基化蛋白,然后用胰蛋白酶酶解,再在多肽的层次上用Jacalin再次富集O-糖基化多肽。凝集素可以通过亲合作用结合相应的糖型,因此可以通过改变凝集素的种类富集不同糖型的蛋白。但由于这种亲合作用的结合强度(Kd>10-6)远远低于抗原抗体的亲合作用强度(Kd<10-9),所以凝集素富集方法特异性不高。2.2离子对质谱分离亲水色谱常用来进行糖和糖肽的分离。因糖链自身为亲水基团,糖基化的多肽相比其他多肽有更强的亲水性。常用于糖分离的亲水色谱柱有SepharoseCL,polyhydroxyethylA,ZICue5f8-HILIC,LunaNH2等。梁鑫淼等报道了一种新型的麦芽糖固定相色谱,在糖肽的分离上有优异的表现。为了提高亲水色谱分离富集糖肽的效率,Ding等在亲水色谱中使用了离子对试剂,如NaCl、HCl或TFA。离子对试剂和多肽结合以后,增强了多肽的疏水性,扩大了糖肽和非糖肽之间的亲水性差异,使得在亲水色谱中,糖肽的保留值普遍大于非糖肽的保留值,从而实现了糖肽与非糖肽之间的高效分离。这种方法称作离子对正相液相色谱(IP-NPLC)。如果先用PNGaseF将N-糖肽上的糖链切除再进行IP-NPLC,就可以消除N-糖基化的干扰只分析O-糖基化的多肽。亲水色谱不仅能使糖蛋白/糖肽与普通蛋白/多肽互相分离,还能实现不同聚糖之间的分离,因此在蛋白质糖基化分析中是非常重要的技术。2.3国物化学上的硼法硼酸可以和糖类物质中的邻二醇结构在碱性条件下形成环状二酯,并在酸性条件下可逆解离。利用此性质,硼酸修饰的材料可以非歧视性地富集N-糖基化和O-糖基化的蛋白或多肽。但在实际样品分析中,用硼酸富集糖肽的报道还不多见。这可能是由于硼酸富集方法对实际复杂样品中糖肽的选择性不够理想。近期,邓春晖等制备了表面硼酸修饰的磁性纳米材料和纳米金胶材料,陆豪杰等制备了表面硼酸修饰的纳米介孔材料,我们期待这些新颖的纳米复合材料在实际样品蛋白质糖基化分析中的应用。缺少特异性是硼酸法的特点。根据不同的情况,这可能是优点,也可能是缺点。研究者应根据具体情况决定是否使用。2.4其他氧化和捕收剂提取n-糖的活性肼化学捕获法的一般过程是:使用高碘酸钠将糖蛋白糖链上的邻二醇结构氧化为醛,然后使用肼修饰的微球进行捕捉,从而使糖蛋白和其他物质分离。分离后一般使用PNGaseF将N-糖基化蛋白的多肽链从微球上游离,从而可对N-糖基化蛋白的种类和N-糖基化位点进行分析。但对于N-糖链结构及O-糖基化蛋白进行分析需要其他的方法。Nilsson等通过对糖蛋白糖链末端唾液酸的选择性氧化和捕捉,避免了高碘酸钠对糖链整体结构的破坏,之后配合酸水解的解离方法可以对N-糖和O-糖进行分析。具体方法是:使用低浓度的高碘酸钠在低温选择性地氧化唾液酸并产生醛基,使用肼修饰的微球将被氧化的唾液酸捕获,将唾液酸化的蛋白质或多肽与其他物质分离,之后用甲酸解除唾液酸与其他单糖之间的连接,由此获得除唾液酸以外的糖肽(图2)。使用这种选择性氧化-肼化学捕捉-酸水解的富集方法,Nilsson等从脑脊液中鉴定到44个O-糖基化位点。Medzihradszky等则通过(较长时间)高碘酸钠氧化-肼微球捕捉和羟胺交换游离方法实现了O-GlcNAc修饰多肽的富集。肼化学捕获法能得到较高的特异性,但也存在步骤较复杂、对糖链结构有一定破坏的缺点。2.5毛细管电泳检测毛细管电泳(CE)是以毛细管为分离通道,依据样品中各组成之间电离度、淌度和分配行为上的差异,从而在强电场中实现分离的一类液相分离技术。可用于糖链分离的毛细管电泳分离模式有:胶束电动毛细管色谱(MEKC)、毛细管电色谱(CEC)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管区带电泳(CZE)。研究表明,高效毛细管电泳(HPCE)具有分离效率高(理论塔板数达106—107/m)、快速(20—30min)、样品用量少(仅为纳升级,可对单细胞液进行分离分析)、灵敏度高(用激光诱导荧光检测器,可达1×10-24mol的超低检测限)等优点。因为以上优点,毛细管电泳在分离相似糖链结构时是很好的选择。Novotny等系统介绍了与糖链分析相关的毛细管电泳-激光荧光和毛细管电泳-质谱等分析技术。Cai等报道了一种基于芯片的毛细管电泳与四级杆-时间飞行质谱联用分析O-糖基化多肽的技术。Neusüue55e等使用CZE-ESI-MS对rHuEPO蛋白中的O-糖基化多肽进行了成功的分离分析。尽管如此,毛细管电泳由于存在处理样品少和很难进行馏分收集等缺陷,该技术在糖蛋白质组学方面的应用受到了一定的限制。2.6分离单元-分子矩阵电泳黏蛋白(mucin)是上皮黏液的主要成分,具有高分子量(约200万)和高度糖基化(糖链占其分子量的50%—90%,富含O-糖链)的特点。在肿瘤发生发展过程中,mucin的表达调控被打乱,其O-糖链结构也发生变化。因此,mucin及其O-糖链有可能作为各种癌症的早期诊断标志物。尽管mucin有很重要的生物学意义,但是凝集素亲合富集和蛋白质组学的技术对mucin的研究贡献不大。困难在于mucin基本上很难用蛋白酶进行酶解,并且由于其分子量很大和含有大量糖链的原因,限制其不能通过普通的SDS电泳进行mucin的分离。琼脂糖/聚丙烯酰胺凝胶曾被用在mucin的分离分析中。分离后的mucin被转移到PVDF膜上进行β-消除及后续分析。但对于不同的目标mucin需要配制不同浓度的凝胶,同时受转膜效率的影响因此很难进行定量分析。支撑分子矩阵电泳(SMME)是被分析对象根据在支撑物质与分子矩阵中的亲疏水性分布差异,而导致不同保留行为的一种新型电泳方法。在对mucin的分离中,使用PVDF膜为支撑材料,聚乙烯醇(PVA)作为分子矩阵,PVA中的亲水羟基背向PVDF膜而朝向溶液。在此电泳系统中,蛋白质的电泳速率将取决于它的质荷比和它与PVA羟基之间的相互作用。蛋白质由于糖基化程度的不同,导致与PVA羟基之间的作用不同。Mucin或蛋白聚糖因为糖基化程度大,其运动速率较小,因此容易达到与其他蛋白相分离的目的(图3)。电泳分离之后可通过阿尔辛蓝(Alcianblue)对mucin或蛋白聚糖进行染色分析。这种针对蛋白聚糖或mucin的SMME方法十分简便,并有可能应用在临床检测中。但采用本方法实现对其他糖蛋白的分离还未见报道。2.7o-glcnac多肽标记方法O-GlcNAc修饰是一种单个单糖的O-糖基化修饰,并不进一步形成复杂的糖链。O-GlcNAc的修饰与去修饰周期较短,具有与磷酸化相似的动态性。为了富集O-GlcNAc多肽,可以利用酶或化学方法对O-GlcNAc进行生物素标记,之后利用生物素亲合色谱即可富集到O-GlcNAc的肽段。标记的方法目前主要有:(1)利用一种变异改造的β-半乳糖基转移酶(Y289LGalT)在GlcNAc上连接一个含有酮基的糖,再利用酮与氨氧基的反应连接一个生物素基团;(2)利用酶促反应转移一个含有叠氮的单糖GalNAz,再利用炔与叠氮的反应连接生物素基团。这几种酶-化学方法是比较有效的,但其复杂性限制了它们的推广。3蛋白/多肽的电泳分析富集到O-糖基化蛋白/多肽之后,解除多肽部分和糖链的连接往往有利于对糖链或糖基化位点的分析。最常用的策略有β-消除法和pronase水解法。β-消除使用亲核试剂(一般是用碱,如氨水等)进攻Ser或Thr,从而将O-糖基化蛋白质糖链切除。Kakehi等报道了一种装置化的β-消除方法,可以将反应时间由数小时缩短至3min,同时收集到糖链并将多肽去除。他们通过这种仪器化的β-消除从各种白血病细胞系和上皮细胞系中得到O-糖链,并进行了后续的比较分析。β-消除后对糖链使用NaBH4还原或进行化学标记(如采用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)等试剂进行荧光标记)是比较常用的处理方法;对蛋白/多肽的处理一般是使用亲核试剂进行加成,称为“β-消除-Michael加成(BEMAD)”。常使用的加成试剂有DTT或巯基乙醇等,也有报道用甲胺、二甲胺或乙胺同时作为碱和加成试剂的方法。进行加成的部分在质谱中比较稳定,并且其独特的质量标签能提供有效的信息帮助糖基化位点的鉴定,因此在O-GlcNAc分析中较为常用。O-糖基化多发生在富含Ser和Thr的序列中,因此用trypsin进行酶解会得到分子量较大的多肽(Mw>5000Da),难以用质谱进行分析。采用非特异性蛋白酶pronase(链霉蛋白酶,为蛋白酶的混合物,包括一些内肽酶,氨肽酶和羧肽酶)可以对蛋白质进行彻底水解。糖链可能对pronase的酶解造成空间位阻,因此在糖链附近肽键的水解受阻。由此可将非糖基化的氨基酸去除,最终获得一段糖肽(氨基酸残基数一般为2—10个),而残余多肽的长度可以由pronase酶解时间的长短来调节。Massolini等制作了pronase酶反应器,大大减少了分析时间。Lebrilla等发展了固定化pronase的新方法,可将pronase处理蛋白的时间缩短至30min。蛋白质或多肽结构的存在可能会阻碍碱性基团对O-糖基化位点的进攻,并影响β-消除反应的效率。Mechref等先使用pronase充分破坏多肽结构,然后再进行β-消除,并对游离出来的糖链进行了全甲基化处理。这种方法提高了β-消除的效率并显著提高了灵敏度。Müller等则使用了氧化-消除循环(先用NaIO4进行氧化,然后用氨水进行消除反应),经过几个循环以后可以将糖链从蛋白质上彻底地切除,从而便于对糖基化蛋白的分析。4质量分析4.1o-糖基化的质谱分析方法由于糖蛋白的糖链往往存在唾液酸化和硫酸化现象,故在正离子模式中它们(或糖肽)的信号较弱。但在质谱的阴离子模式中却可以利用这些负电荷的基团而达到较高的分析灵敏度。Hansson等先用免疫共沉淀纯化了CD43和Muc1,对从β-消除游离出的糖链进行负离子模式的LC-MS分析。灵敏度达到低飞摩尔级(lowfemtomole),从1×106的细胞即可得到相应蛋白的O-糖基化结构信息。国际糖组学/蛋白质组学组织(HGPI)对于主要的O-糖基化质谱分析方法进行了大规模的实验评价。从骨髓瘤病人的血清中取得了3份IgA并送到全世界的15个实验室进行O-糖基化的分析。研究结果认为在正离子模式中对全甲基化还原糖链的直接质谱分析,以及在负离子模式中对还原糖链的LC-MS分析能给出最为可靠的数据。4.2质谱ms2或多级质谱基因一级质谱仅能检测糖肽或糖链的质量数,对于结构解析,则需要串级质谱(MS2)或多级质谱(MSn)的数据。本小节将简要介绍在蛋白质糖基化分析中的几种串级质谱模式,包括碰撞诱导解离(CID)、电子捕获解离/电子转移解离(ECD/ETD)和红外多光子断裂(IRMPD)。4.2.1多级cid分析碰撞诱导解离(CID)是最经典和常见的串级质谱方法。离子肼质谱,如岛津公司的AXIMA-QIT和Thermo公司的LTQ都能够进行多级CID串级质谱分析。利用AXIMA-QIT的串级能力并结合使用糖苷酶,Keita等对从白血病细胞系和上皮细胞系中取得的O-糖链进行了分析和结构验证。4.2.2糖基化位点分析对于糖肽来说,质谱中最常用的串级质谱方法CID往往会带来糖链的解离,因此很难从糖链碎片信号充斥的谱图中找到关于多肽的信息并确定糖基化的位点。电子捕获解离/电子转移解离(ECD/ETD)的出现,提供了一种从糖肽中分析糖基化位点较为便利的手段。ECD/ETD一般只断裂多肽的骨架,产生c/z离子,与此同时糖链基本保持稳定不断裂。如果能得到较为完整的c/z离子序列,就可以从质谱图中推断糖基化的位点。O-糖基化位点分析对ETD的效率提出了较高的要求,这是因为如果没有完整的c/z序列就很难确认糖基化位点。但是O-糖基化经常发生在富含羟基的区域且往往含有酸性单糖。将酸性单糖切除再进行ETD分析是必要的。化学修饰如胍基化、双甲基化或咪唑化等也可提高ETD的效率。4.2.3糖基化黏蛋白的质谱条件一般在傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICRMS)中进行的红外多光子断裂(IRMPD),是一种非碰撞的串级质谱方式。糖肽的IRMPD断裂主要是发生在糖苷键上,能够提供丰富且易于解读的结构信息。Lebrilla等研究了糖基化黏蛋白中O-糖肽在IRMPD中的断裂方式,包括不同组成和电荷数的糖肽在IRMPD中的断裂。质子化的O-糖肽主要经历糖苷键断裂(全覆盖度)和多肽链断裂(部分覆盖度);从加钠的O-糖肽获得的信息与质子化O-糖肽的基本类似;去质子化的O-糖肽可以提供未糖基化的Ser/Thr残基的侧链信息,由此可以间接地推测O-糖基化的位点。因此结合使用正负离子模式和IRMPD可以确定O-糖基化位点。受仪器条件的限制,IRMPD的报道较少。但在最新的LTQVelos质谱仪(Thermo)中,也可以进行IRMPD串级质谱分析,并可达到比CID更高的效率和灵敏度。随着这类新仪器的推广,IRMPD将在蛋白质和蛋白质糖基化分析中发挥更大的作用。5蛋白/多肽的比较分析通过质谱的定量分析有助于对各种生理病理条件下不同的蛋白/多肽进行比较分析,找到与表型差异或刺激相关的变化。对蛋白质糖基化的定量分析包括对糖肽的定量和对糖链的定量两方面。5.1糖基化位点标记定量蛋白质组学提供了多种对蛋白质的定量方法,如ICAT、iTRAQ、18O标记、甲基化、SILAC等。但为了避免非糖基化多肽的干扰,除了必要的富集手段外,往往需要利用糖基化相关的反应。在N-糖基化分析中,可以利用PNGaseF酶切过程对糖基化位点进行18O标记。杨芃原等则发展了串联18O标记法(TOSIL),使糖基化的多肽产生质量数相差为6Da的对峰,而非糖基化的多肽则产生质量数相差为4Da的对峰。在O-糖基化分析中,利用同位素标记的DTT(d0,d6)也可对糖基化位点进行β-消除-加成(BEMAD)标记分析。5.2糖链还原amicaract和活性化合物标记对糖链的定量分析主要是通过体外途径或体内途径对糖链进行稳定同位素标记,并结合质谱分析完成的。在体外标记中,糖链先通过化学或酶的方法与同位素标签