305-牛津杯法抑菌试验

牛津杯法抑菌试验1.原理将加有牛津杯的双层平板置于培育箱中培育，一方面试验菌（病原菌）起先生长繁殖，另一方面抑菌物质呈球面扩散，形成递减的梯度浓度。牛津杯四周抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透亮的抑菌圈，抑菌圈的大小反映抑菌物质对指示菌的抑制程度。.仪器、设备超净工作台恒温培育箱:36±l℃o恒温水浴锅：50±l℃o局压灭菌锅。平皿：直径为9cm。移液器（20〜200匹,100-1000gL,1〜5mL）及配套无菌枪头。试管：15x150mm。酒精灯。试管架。涡旋混匀器。摇床：36±l℃o牛津杯。.病原菌、培育基及其他病原菌：大肠杆菌：ATCC25922、沙门氏菌:ATCC14028、金黄色葡萄糖球菌：ATCC6538o抑菌物质：益生菌（乳酸菌、芽抱菌）、抗生素或其它抑菌物质。培育基：（1）大肠埃希菌：养分肉汤、养分琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、养分琼脂（琼脂粉含量：2%）o（2）金黄色葡萄球菌：养分肉汤、养分琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、养分琼脂（琼脂粉含量：2%）o（3）沙门氏菌：养分肉汤、养分琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、养分琼脂（琼脂粉含量：2%）o（4）乳酸菌：MRS肉汤。（5）芽胞菌：养分肉汤。其它：0.85%灭菌生理盐水，灭菌蒸储水。4测定流程病原菌扩培：在超净工作台内，挑取簇新的斜面保藏病原菌1环，接种于100mL无菌的养分肉汤培育基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37℃,200rpm,培育16-20h。将培育好的病原菌菌悬液用空白养分肉汤培育基稀释10倍，若OD600在之间，则为有效病原菌菌悬液，此时病原菌菌悬液原液中病原菌含量约为109cfu/mlo4.2抑菌物质（抗生素或益生菌菌悬液）的制备：（1）抗生素：抗生素或其它药物用无菌水稀释至所须要的浓度。（2）乳酸菌扩培：无菌条件下称取相当于约10亿CFU量的乳酸菌菌粉（假如是包衣产品须要在称样前无菌条件下研磨释放乳酸菌），接种于lOOmLMRS液体培育基中，37℃静置培育24〜48h即为扩培好的乳酸菌菌悬液。（3）芽抱菌扩培：无菌条件下称取相当于约10亿CFU量的芽泡菌菌粉，接种于100mL养分肉汤培育基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37℃ ,200rpm,培育14〜18小时即为扩培好的芽胞菌菌悬液。双层平皿的制备：取 平 皿分别倾注养分琼脂培育基15-18mL,使其在平板内匀整摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层，将平皿倒置平均划分区域并标记添加物。另取半固体养分琼脂培育基适量放冷至48s50C,将4.1中病原菌菌悬液原液稀释至106cfu/mL左右，每4.5mL半固体养分琼脂培育基加入0.5mL,倒入每平皿中，使其在底层上匀整摊布，作为菌层。放置在水平台上冷却后，在每1平皿中以划分好的区域等距离匀整安置牛津杯4个备用。抑菌试验：取4.2步骤中准备的抑菌物质，每个双层平皿中的牛津杯中分别滴装200|iL,37℃静置培育16-20h后，测量各抑菌圈直径（或面积）以作出评价。选取典型平皿拍照片。备注：①牛津杯的放置确定要平稳、到位，确保底部精确插到两层平 皿之间；②抑菌物质添加时确保全部加到牛津杯内部，不要洒在牛津杯外壁或外部，假如洒在外面会形成乳酸菌或芽抱菌在抑菌圈的生长；③假如无法限制乳酸菌或芽抱菌在牛津杯外面的生长，可以将乳酸菌、芽胞菌菌 悬液在无菌离心管中离心，取其上清加入牛津杯中做抑菌试验。抑菌性能评价抑菌性：抑菌圈V10mm为无抑菌作用，抑菌圈＞1