大豆多肽分离纯化技术研究进展

大豆多肽分离纯化技术研究进展

大豆氨基酸对外部环境非常敏感。如果酸、碱、高温和沉重的振动，它们可能会导致无序。它们原始液组成复杂，目标产物浓度较低(一般<5%)，还含有大量其他杂质，其中有些杂质的物理化学性质和目标产物接近，这就给大豆肽的分离纯化带来很大困难。传统多肽的分离方法有吸附沉淀、溶媒、萃取、离子交换法等，这些工艺往往繁杂，提取时间长，消耗大量原料，能耗高，产品回收率低。随着生物技术的发展和对大豆肽结构和功能研究的深入，对大豆肽分离检测研究也有了迅速发展，出现了许多高效的分离纯化技术和手段，主要包括高效液相色谱，毛细管电泳、膜分离等。本文针对这些仪器的基本原理及分离模式，对用于大豆多肽分离纯化的研究进展进行了综述。1.1膜离离法1.1.1超滤技术的应用潘巧明探讨了大豆蛋白浓缩的工业化生产中，各种条件对聚砜中空纤维膜性能的影响。袁其明用分离技术处理大豆乳清废水，截流分子量为8000Da的超滤膜，几乎可以回收所有多肽和蛋白质，再用纳滤膜进行浓缩，回收了蛋白质、低聚糖，又大大降低了废水排放量，取到了满意效果。Turgeon等利用超滤膜技术，在线透析改变缓冲液的条件，缩短了分离纯化的时间。沈蓓英运用不同种类的蛋白酶，控制酶解温度、水解时间、水解pH及底物浓度，利用中空纤维超滤，实现对大豆蛋白抗氧性多肽的提取回收。1.1.3、纳滤、微滤技术联用目前，多种类型膜分离技术在生化产品应用中协同发展，超滤、纳滤、微滤技术联用，取长补短，实行多级分离是大豆多肽分离纯化的发展趋势。PerMunkNielsend等采用超滤和纳滤对大豆水解物进行分离纯化，获得满意效果。1.2分离纯化和制备条件的确定高效液相色谱(HPLC)因其分离柱效高，选择性好，已成为大豆多肽类物质快速分离纯化和分析的强有力手段，利用HPLC不仅可以在短时间内完成分离的目的，而且还可制备生物活性多肽，因此分离纯化和制备条件的选择目前已成为学者研究的热点。Wilce等利用HPLC，采用线性回归方法对2106种肽保留性质与结构进行分析，得出不同氨基酸组成对保留系统影响的关系。Henderson等报道了肽链长度、氨基酸组成、温度等条件对保留值的影响，得出了每种多肽分离纯化的最佳条件。Tisso等利用HPLC，采用多次分离的方法，分离纯化出一种能够提高免疫力和抗球菌等细菌侵袭的三肽。此分析方法快速简便，非常利于大豆多肽的分离纯化。1.2.1可溶性蛋白质的活性物质及活性Krusa等用RPLC对大豆蛋白进行了纯化和定量分析，Chen等结合离子交换、凝胶过滤和RP-HPLC用反相色谱梯度洗脱法分离了6种标准肽。邓亦峰等采用HCl水解，反相高效液相色谱柱前衍生方法，测定了碱性蛋白酶处理可溶性蛋白质中的AA含量。结果表明，所选方法准确，结果不受蛋白质中AA组成变化的影响。大量的科学实践表明，低pH流动相，室温或较高温度及使用乙腈或异丙醇作为有机部分，最常用的添加剂三氟乙酸(TFA)作为RPLC离子对，是大豆肽较好的分离条件。目前RPLC分离柱为硅胶基质的键合相填料为主体，对键合C18、C8烷基和苯基填料的研究，进一步提高了柱效和选择性,因而高分子基质的RPLC填料的改性是当今研究的热点。白泉等利用德国的Nucleosil4000-7C18反相色谱填料，成功地对两种化学合成多肽32肽、21肽进行了分离，并制备纯肽各100g。1.2.2iec的洗脱Wu等报道了利用离子交换色谱法，分离了三种蛋白质的酶，并探讨了分离提取条件，为分离此类物质提供了有价值的数据。线性离子浓度梯度洗脱是IEC最基本的洗脱方式，通常大豆多肽浓度洗脱采用磷酸盐。Kostel报道了用Tris或柠檬酸缓冲溶液的流动相中改变NaCl或KCl浓度以达到洗脱目的。韩香等报道了多肽分子分离纯化的正负吸附离子交换色谱及各自的优点。在制备纯化中，使用离子交换柱十分方便，效率高，已成为大豆多肽一个重要的分离方法。1.2.3抗菌肽的提取冯杰龙等报道了利用SephadexG100凝胶柱分离，再用CM-SephadexpH等于5和pH等于6.5两次离子交换柱成功地分离提取35～39肽的抗菌肽。Ljevakovic等选用凝胶过滤色谱SephadexG25和SP-SepadexC-25离子交换色谱，分离了肽聚糖单体衍生物。1.3离的液相分离技术毛细管电泳是继高效液相色谱之后，将电泳技术和色谱技术相结合的一种新的分离技术，它是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。在高压作用下，带电粒子在毛细管内的溶液中迁移，迁移速度等于电泳和电渗流的矢量和。各种粒子因迁移速度不同而实现分离。具有分离率高、快速、用量少等优点，是分离大豆多肽物质的有效工具。随着电泳技术的发展，以毛细管区带电泳(CZE)、胶束电场毛细管电泳(MECC)、毛细管等速电泳(CITP)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等点聚焦(CIEF)等为代表的HPCE分离模式大大拓展了大豆多肽分离纯化的运用范围，加之与紫外吸收、激光诱导荧光电化学及质谱等检测手段相结合，更加确定了其在多肽研究领域的重要地位。1.3.1带正电荷多肽MeCormick通过选用低pH缓冲液和降低电渗流，减少带正电荷多肽与带负电荷的解离硅羟基间相互作用，而使分离效率大大提高。林柄承等利用CZE成功将九个多肽组合分离。Issaq等利用CZE方法研究分离了5个9肽，分离速度快速准确。1.3.2无胶：颗粒结构的mecc分离据报道，环糊精加入，可使峰形变窄，荧光强度增加，更利于大豆多肽的分离纯化。Liu等报道了加入环糊精，可使含疏水结构的大豆多肽选择性与环糊精的环孔作用而得到分离,同时其荧光强度明显增加。最近在无胶筛分毛细管电泳中，使用不同结构特性的混合表面活性剂或加入筛分介质来控制溶质——胶束间的相互作用，从而提高MECC的选择性和分离度引起人们的探讨。陈等利用PEO和SDS与Tris等表面活性剂，成功将大豆蛋白酶水解液中大豆多肽进行了分离和检测。1.3.3毛细管凝脉电泳CaoillaryGelElectrophoresisCGE1.4hplc-ms-ce联用技术分离大豆多肽物质大豆多肽的种类很多，大多具有相似性，使用单一的分离纯化手段已经不能达到理想的效果。毛细管电泳分离纯化效果好，但也存在处理样品少、不能进行制备等缺点，而HPLC可以进行大规模制备，特别是反相高效色谱RPLC具有分离效果好，分辨率高，回收率高，但费时、价高等特点，因此联用技术在大豆多肽分离纯化中已显示出巨大的优越性。HPLC-MS联用已成为大豆多肽物质快速分离鉴定的有力工具，通过质谱可实现对大豆多肽物质自动分离检测。我国科学家谷胜人利用HPLC-MS联用技术与电喷雾离子化质谱，成功地对多肽混合物进行了分离检测。Hoffmann用HPLC-MS分离技术在3.5min内完成了多肽分离鉴定。在大豆多肽物质分离中，HPLC-CE联用技术具有独特优点：选择性高、灵敏度高、快速简便，可用于梯度洗脱，特别适合大豆多肽的分离纯化。把混合物先采用GC-MS进行分离分析，再用CE进一步分离纯化，可以提高大豆多肽分离检测效果。Pedro等应用HPLC-MS-CE联用技术，分离了多组分肽混合物。另外，高效毛细管电泳与毛细管区带电泳（CZE）等联用可以很好的分离一些复杂的大豆多肽物质。2大豆多肽物质分离纯化的技术随着大豆多肽分离纯化技术的进展，大大加快了新活性大豆肽的发现和合成速度，在大豆多肽合成中，许多杂质显示出与目标产物相类似的性质。随着肽链的增长，分离难度也增大，需要方便、快速、灵敏准确、通用性好的分离纯化方法来支持。同时对大豆多肽物质分离纯化给蛋白质组学和分析化学研究人员提供了一个广阔的前沿领域。因此，建立一套完整的大豆多肽物质分离纯化技术具有十分重要的意义。随着科学技术和蛋白质组学的不断发展，将有更多的化学研究人员热衷于大豆多肽的分离纯化，也将会涌现出更多的分离纯化技术，这一领域的研究具有广阔的前景。1分离纯度1.1.2色谱分离技术gfc超滤在大豆多肽物质浓缩应用上越来越引人关注。目前超滤方法研究工作主要集中在膜材料选取方面。大豆多肽物质具有热敏性，受热易被破环，采用传统的提纯方法不易除去低分子量的盐分，从而影响产品的纯度。采用纳滤浓缩，既可降低能耗，还能将有机污染物和盐分除去，达到提高产品质量的目的。Pouliot用荷电超滤-纳滤进行了由胰蛋白酶水解乳清蛋白，分离得到多肽的实验。Timmer使用各种聚合物超滤-纳滤膜测试了分离氨基酸的效果，并应用于混合氨基酸的分离。在大豆多肽分离纯化中，微滤与其他技术联用，以达到分离提纯的目的。刘国庆等采用微滤和絮凝离心技术联用，回收大豆蛋白中的生物活性大豆肽，分离效果好，将悬浮固体完全除去，脂肪去除率高，达99%。反相高效液相色谱利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂(甲醇、乙腈等)或水溶液作流动相，根据流动相中被分离溶质极性(疏水性)的差别发生强弱不同作用，使其在两相中分配不同，进行分离纯化的色谱洗脱法。疏水性较弱的大豆多肽分子和固定相间的相互作用较弱，因此较快流出；反之，疏水性相对较强的大豆多肽分子较后流出。由于使用挥发性冲洗剂(三氟乙酸-乙腈)作为流动相，纯化产品不必脱盐，所以大大简化了操作步骤，尤其对1000Da以下小分子大豆肽类物质分离纯化更为重要。RP-HPLC分离多采用降低流动相极性(水含量)的线性梯度洗脱法及窄梯度并延长洗脱时间方法：在初始洗脱条件下，洗脱液中有机成分浓度较低，大豆肽分子与固定相疏水作用较强，几乎完全被固定相吸附。而一旦洗脱液中有机成分达到特定浓度，使得大豆多肽与固定相间作用小于流动相与固定相间的作用时，分子便可从固定相上洗脱下来，几乎不再与固定相发生作用。洗脱液成分极微小改变就会大大影响大豆肽的保留行为，从而保证疏水特征相近的小分子大豆肽得以充分分离。离子交换色谱广泛用于大豆多肽的分离纯化。由于大豆多肽在一定pH和离子强度条件下带电有微弱的差异，和离子交换剂靠静电力结合在一起时，进入介质表面的可交换离子与带相同电荷的蛋白质分子就会发生交换的差异而分离。离子交换剂分为阴离子交换剂和阳离子交换剂两大类，目前大豆多肽类物质的分离所选用的离子交换介质主要是亲水性共聚物，如一些新型树脂：离子交换纤维素、葡萄糖凝胶、大孔型树脂、琼脂糖凝胶树脂等。由于洗脱剂的离子强度、盐浓度等对分离纯化影响显著，故研究主要集中在分离纯化大豆多肽物质性质、洗脱剂、洗脱条件等方面。GFC也叫凝胶色谱分子筛法，是利用凝胶网状结构，根据分子大小和形状差异进行分离的一种方法。当样品进入凝胶柱后，较大分子不能通过孔道进入凝胶柱体内，而与流动相一起流出层析柱，而小分子则渗入凝胶内。它具有分离条件温和，产品收率高，生物活性好，分离面宽等优点，广泛用于大豆多肽物质的分离纯化中。凝胶色谱主要有Sephadex系列、Sephacry系列、Sepharose系列等。毛细管区带电泳分离大豆多肽的原理是依据不同组分中化合物所带质荷比不同将其分离。分离效率只取决于物质带电性，因而分离准确度高，效果好。但由于大豆多肽易被吸附到毛细管电泳内壁上，而使峰形和电泳时间受到影响，因而根据分离大豆肽的性质，选择不同的分离条件（如柱材料组成、调整电泳液的pH、改变溶质电荷和淌度等）减少吸附，是目前主要研究方向。MECC