多肽类药物有关物质的质量控制

多肽类药物有关物质的质量控制

自1953年合成具有生物活性的第一个多媒体税收刺激（缩写）以来，该药物的研究主要集中在对大脑中不同浓度山羊激素的研究上。在这方面，对神经活性物质和胃肠激素的研究也很活跃。近年来多肽类药物的发展越来越受到医药界的关注,其具有毒副作用低,用量少,生物活性强,疗效好等特点。现在全球已上市的合成多肽类药物有60多种,国内外药典中收载的合成多肽类药物有30多种,还有500~600个进入临床研究的多肽药物,而生物医药产业“十二五”规划和重大新药创制专项,也对多肽药物给予重点扶持。本文就合成多肽类药物的质量控制,特别是多肽类药物有关物质的控制作简要介绍。1国内外多肽类药材、制剂及使用情况较早上市的多肽类药物主要是一些多肽类激素,如鲑鱼降钙素、生长抑素、人高血糖素、缩宫素等。随着新药研发的不断深入,多肽药物的开发已经发展到疾病防治的各个领域如抗肿瘤多肽、抗病毒多肽、多肽疫苗、细胞因子模拟肽、抗菌活性肽、诊断用多肽、减肥用多肽等。多肽类药物的生产主要采用3种方式,即化学合成、动物组织提取和基因重组表达。化学合成已成为多肽类药物的主流生产方式,并具有过程易控制,安全性比较高等特点。一些较为成熟的品种已收载于国内外药典中。见表1和表2。由表2可以看出,5种药典收载的多肽类原料药有22种,ChP2010和USP34及JP16中收载的原料药品种有6种,EP7.0收载了11种。5种药典收载的制剂有26种,ChP2010收载的制剂有8种,USP34收载的制剂有13种,BP2012收载的制剂有11个品种,JP16有1个品种。合成肽类药物进口注册品种现有33个,其中原料药6个,制剂27个;ChP2010未收载的原料药品种有依降钙素、卡贝缩宫素、特利加压素、谷胱甘肽,制剂有鲑降钙素鼻腔溶液、去氨加压素注射剂、去氨加压素片剂、依降钙素注射液、注射用亮丙瑞林微球、卡贝缩宫素注射液、特利加压素注射液、注射用特利加压素、生长抑素注射液、注射用醋酸奥曲肽微球、戈舍瑞林注射液、醋酸阿托西班注射液、注射用曲普瑞林、醋酸曲普瑞林注射液、注射用曲普瑞林控释剂、注射用醋酸西曲瑞克、注射用地加瑞克、注射用恩夫韦肽、谷胱甘肽滴眼液、注射用还原型谷胱甘肽、艾塞那肽注射液、注射用胸腺肽、注射用醋酸兰瑞肽。多肽类药物的剂型多为注射液和注射用粉针,也有一些新剂型,如注射用微球、缓释剂、喷鼻剂等,新剂型能够解决多肽类药物存在的半衰期短、易被酶解、稳定性差等问题。采用何种质控方法、检测哪些项目是多肽类药物质量控制的关键,这些药物中绝大多数为天然活性物质——肽类激素的相似物,应针对品种特点深入研究。2药物质量控制的新挑战多肽类药物是介于传统的化学药物和大分子药物之间的一种特殊药物,其结构特征、合成方法、剂型都有自身的特殊性,因此对这类药物的质量控制和研究,面临新的挑战。2.1多肽类药物的鉴别来自于合成的多肽类药物,质量研究可以参照一般的化学药物的研究思路。质量控制主要包括性状、鉴别、检查,包括一般杂质、有关物质、残留溶剂、晶型、粒度、溶液的澄清度与颜色、干燥失重和水分、异构体,另外还有针对多肽药物的特殊检查项目如氨基酸比值、生物活性检查、相关肽、反离子含量、肽图分析、聚合物、降压物质检查等项目,含量及效价测定。对于合成的多肽,其理化性质除一般的常规项目外,还需要关注等电点、比旋度、缓冲液溶解性等。多肽类药物的鉴别试验,国内多采用液相色谱保留时间的一致性,以及显色反应进行鉴别,国外药典中除采用氨基酸分析的方法,另外,已经有采用质谱、核磁、红外光谱等专属性更高的方法,例如USP34中醋酸戈那瑞林和醋酸去氨加压素鉴别中除采用液相色谱法外,还采用MS测定分子量来鉴别;亮丙瑞林的鉴别中,USP34采用红外光谱和液相色谱2种方法;EP7.0中布舍瑞林采用的3种鉴别方法分别为液相色谱、1HNMR和氨基酸分析;亮丙瑞林采用液相色谱法、红外光谱和氨基酸分析,戈舍瑞林的鉴别采用13C-NMR、液相色谱和氨基酸分析。在国内由于仪器设备较为昂贵,技术水平还未达到等原因,还未见到IR、NMR、MS用于多肽药物鉴别。但是NMR相比于LC-MS来说,两者同样能给出多肽的序列结构信息,而LC-MS已经成为实验室的常用工具,采用此种方法进行多肽类药物的鉴别,不仅能给出较多的结构信息,而且用量少,专属性较高。对于一些相对较长的多肽,除采用化学法和液相色谱法,采用肽图分析是比较专属的鉴别方法。化学合成多肽类药物国内外标准中大多采用反相高效液相色谱的方法进行含量测定,紫外检测器210nm到220nm波长下进行测定,采用梯度洗脱,计算采用对照品外标法进行。由于杂质组成较为复杂,对此类药物的含量限定范围也比一般的化学小分子药物宽,按无水、无酸计,据统计其下限和上限分别为93.9%±2.3%和103.6%±1.3%。2.2新型量质控制多肽类药物因其易被酶解、半衰期短、脂溶性差而多选择注射途径给药,主要剂型为冻干粉针和注射液。采用缓释及控释技术可使多肽类药物不被酶解延长效用,新的制剂如注射用醋酸奥曲肽微球、注射用曲普瑞林控释剂、注射用亮丙瑞林微球、戈舍瑞林埋植剂等;其他还有一些非注射给药的剂型,如口服制剂(胸腺肽肠溶片),鼻喷剂和滴鼻剂(布舍瑞林、去氨加压素、鲑降钙素等)。对于一般的注射液和注射用冻干粉针,由于多肽类物质不稳定易被降解的特点,质量控制的项目重点关注有关物质检查项。目前出现的新剂型的分析方法有待进一步研究和规范,如注射用微球质量控制应重点关注含量测定,释放度,微球制备中使用的溶剂,形态及粒度的分布,载药量和包封率等项目及其分析方法。注射用微球的含量测定不像一般常规制剂那样简单,如注射用曲普瑞林微球需要较为复杂的样品前处理过程,再进行HPLC分析。注射用胸腺五肽微球的体外释放度实验是控制制剂质量的关键项目,由于其属于缓释制剂,体外释放实验需要较长的时间,GuoAi等在较高的温度(45℃、50℃和55℃)条件下,实现了胸腺五肽微球的加速释放,特别是在50℃条件下,能够在30h内预测37℃时常规释放30d的释放度水平,而且相关性良好,调整释放条件,可以采用加速释放的方法评价胸腺五肽微球的体外释放。3法规制多肽类药物多肽类药物由不同种氨基酸按照一定的顺序组合而成,相比于小分子药物需要经过的合成步骤比较多,由此产生的有关物质较为复杂。合成多肽的有关物质可以分为四类,主要为:(1)合成过程中带入的工艺杂质:缺失肽,断裂肽,插入肽,未脱保护肽等肽类相关物质;(2)降解杂质:多肽脱酰胺,氧化,还原,水解,二硫键错配,β-消除等不稳定因素而产生的降解产物;(3)聚合物:二聚体及多聚体;(4)光学杂质:消旋化,非对映异构体杂质。多肽类药物制剂主要是注射液和注射用粉针,在生产和储存过程中更易发生降解变化,产生降解杂质。合成多肽中由于杂质众多,成分较为复杂,性质各不相同,有的与多肽药物很相似,有的差别较大,有些杂质在较低浓度下也可能产生较大的毒性。据有关研究报道,多肽中有一两个氨基酸次序发生变化,就有可能将激动剂变为拮抗剂,产生相反的作用,药物的安全性不仅仅与主要活性成分的毒性亦与杂质的毒性有关,所以建立适宜的方法检出这些杂质并进行分析评价,是进行多肽类药物质量控制的关键。EP7.0附录“Substancesforpharmaceuticaluse”中已对多肽类药物的有关物质限度进行限定,分别制定了报告限度(0.1%),鉴定限度(0.5%)和质控限度(1.0%)。由此可见,此类药物有关物质的控制研究有待深入。针对不同种类的杂质,须采用相应的检测方法。3.1检测多媒体药物物质的方法3.1.1合成多肽类药物有关物质分析方法高效液相色谱法已经成为药物质量分析中最常用的方法,具有灵敏、准确、快速的特点,多肽类物质是由多个氨基酸通过肽键连接而成,有一定的疏水性,在反相色谱柱上有一定的保留,在反相高效液相色谱中能有效分离,现在多肽类药物的有关物质分析大多采用高效液相色谱法。由于合成多肽类药物中可能含有的有关物质较为复杂多采用梯度洗脱的方法,极个别的采用等度洗脱,如EP7.0中醋酸戈那瑞林,USP34中去氨加压素,亮丙瑞林等。笔者对现行各药典中合成多肽类药物有关物质分析方法做了汇总分析。各药典对共同收载的多肽类药物有关物质的分析方法,大多数一致,但也存在不一致的品种,如醋酸戈那瑞林,去氨加压素在USP34与EP7.0采用不同的流动相体系,究竟哪种流动相体系更适于该种药物的分析,还需进一步探究。3.1.2毛细管电泳法除采用传统的高效液相色谱法进行有关物质分析外,毛细管电泳用于多肽类药物的分析也具有较大的优势,毛细管电泳兼具有高压电泳及液相色谱法的优点,与反相高效液相色谱法的疏水性的分离机制不同,存在多种分离模式,具有分析速度快,分辨率高,样品用量少,操作简便,消耗少等特点。毛细管电泳在各国药典中的应用也越来越多,USP、BP、ChP均收录了毛细管电泳法,并详细介绍其定义、分类、基本原理、仪器构造及操作参数等,并且在USP、BP中,已经有多个药物品种的质量标准中使用了毛细管电泳,UlrikeHolzgrabe综述了毛细管电泳在EP、JP、USP中的应用,其在杂质分析特别是在多肽蛋白类药物杂质分析中,具有很大的优势,目前多肽类药物的质量控制中采用毛细管电泳作为检测方法的还比较少,EP7.0中,谷胱甘肽的有关物质测定采用毛细管电泳法。Ridge等报道了用毛细管电泳和高效液相色谱法对缓激肽的纯度进行分析,用磷酸调节pH在不同条件下分离出不同的杂质,而采用HPLC法显示只有1个缓激肽主峰。Catai等采用双涂层毛细管柱分析重组人生长激素(hGH)的纯度,将hGH与其脱氨产物剪切产物18位氨基酸Gln突变产物有效分离。未来随着毛细管电泳方法本身的不断完善以及仪器的发展,克服自身在重现性和精密度不高的缺点,毛细管电泳(CE)将逐渐成为多肽类药物分析的有力工具。3.1.3在化学药物及激素方面的应用液质联用技术目前已经成为分离鉴定各种化合物的重要手段,MS是强有力的结构解析工具,能为结构定性提供较多的信息,作为理想的色谱检测器,不仅特异性强,而且具有极高的检测灵敏度。自从“软电离”技术的出现为分析强极性,难挥发,不稳定生物大分子提供了可能,生物质谱随之发展起来,现在HPLC-ESI-MS/MS广泛应用于多肽蛋白等生物大分子的分离分析中,用于进行分子量测定和结构分析。采用液质联用进行有多肽类药物有关物质分析时,可以在不得到纯杂质的情况下,给出杂质的一级甚至多级质谱信息,从而获得该杂肽的分子量及序列信息,为相关肽定性和结构解析提供依据。通过查阅国内外有关文献,发现目前采用液质联用的方法进行化学药物及抗生素有关物质的研究,对多肽类药物有关物质的研究报道还比较少。唐新科等利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)与电喷雾质谱(ESI/MS和MS/MS)联用技术分析了合成的十三肽粗产品,并对主成分及副产物进行结构解析,结果显示粗产物主成分确实为目标肽,副产物为十三肽的残缺肽和氧化肽。李萍等运用纳升级电喷雾串联质谱法成功对末端修饰的多肽曲普瑞林和未知多肽的一级结构进行确证。目前采用液质联用的方法对未知多肽杂质进行结构解析还存在一定的困难,杜甫佑等采用LC-ESI/QTOF-MS技术,系统研究了系统素(Systemin)及相似多肽的质谱裂解机理和色谱保留规律,为准确研究确证多肽药物及激素结构提供了参考。戈舍瑞林是一种合成的,促黄体生成素释放激素的类似物,V.Sanz-Nebot等采用LC-ESI/MS对固相合成所得的戈舍瑞林粗品进行分析,对其中的副产物进行了结构鉴定。替可克肽是一种人工合成的二十四肽促皮质激素,Angelina等采用毛细管电泳及液相色谱与飞行时间质谱联用的方法,对替可克肽的杂质进行研究,给出了合成过程中产生的41个相关肽的结构,结果显示CE-MS对各种缺失肽能够较好的分离,LC-MS对其中存在的未脱保护的tBoc,或tBu分离效果较好。3.1.4高分子聚合物检测高效分子色谱法是根据分子大小进行分离的一种液相色谱技术,常用于蛋白质多肽的分子量测定、生物大分子聚合物与分子量分布的测定和药品中高分子杂质的测定。多肽蛋白类药物原料和制剂在生产及储存过程中,易产生多聚合物和二聚体,这些聚合物易引起过敏反应、毒性及其他不良反应,所以在药物检查中应严格控制此类物质的含量。目前文献及各国药典中对β内酰胺抗生素的检查中均包括高分子聚合物,采用的检测方法为高效分子排阻色谱法,对合成多肽类聚合物的检查很多国内外标准中并没有此项,文献中已有关于鲑降钙素和胰高血糖素中聚合物的报道,多肽蛋白中聚合物的检查也采用高效分子排阻色谱法,如胰岛素的质量标准中,采用分子排阻色谱法控制高分子蛋白物质。对二聚体的检查也可以用反相高效液相色谱法,Ph.Eur7.0苯赖加压素中杂质C,D均为二硫键相连而成的二聚体,采用反相高效液相色谱法便能满足检测要求。3.2杂质谱和肽类杂质控制策略随着人们对药物安全性的日益关注,药物杂质控制已经成为药物质量控制中的关键问题,胡昌勤总结了药物杂质控制理念的变迁,主要概括为三个阶段,即纯度控制,限度控制,杂质谱控制。在早期,药物的杂质控制主要采用简单的分析方法如容量分析、分光光度法等,通过对纯度的控制来间接实现的。随着色谱技术的发展,杂质分析成为药品质量控制的主流,各国药典相继颁布杂质控制指导原则,并通过“已知杂质”、“单个未知杂质”和“总杂质”实现对化学药品中杂质的控制,除此之外有些药物的标准中还对已知杂质给出了具体名称、分子式和结构式,药物杂质的限度控制日趋成熟。21世纪,由于对药物杂质特性以及生物学特性的研究的深入,药品的“杂质限度”理念存在明显的缺陷,从而提出“杂质谱”的理念,即药品中诸杂质的种类及含量,理想的杂质控制理念应该是每一个杂质的来源与结构已知,每一个杂质生理活性清楚,且质控分析方法具有良好的粗放性。针对药品中的每一个杂质,依照其生理活性逐一制定质控限度。2010年版中国药典,部分化学药物品种一开