阿胶的主要成分及质量控制研究进展

阿胶的主要成分及质量控制研究进展

coracoriiasi是马科动物的皮。它是在浸泡和去除泡沫后制成的。与人参、鹿茸并称“中药三宝”,因补血健身效果明显,有补血“圣药”之称。能补血滋阴、润燥止血,用于血虚萎黄、眩晕心悸、肌痿无力、心烦不眠、肺燥咳嗽、吐血尿血、先兆流产、便血崩漏、妊娠胎漏,是中医临床常用的补益药。现代药理研究表明阿胶对缺血性动物的红细胞、血红蛋白及红细胞压积有显著的促进作用,可以明显增强造血功能,升高白细胞的数量。免疫学实验发现阿胶对放疗病人淋巴细胞的促进作用明显,能消除放疗对免疫系统的抑制作用,增加肿瘤坏死因子的数量,有显著的免疫作用和抗癌作用。目前对阿胶的研究多集中在药理方面,为阿胶新用途的开发奠定了基础,但是对阿胶质量控制的研究相对较少。在经济利益的驱使下,不法分子以劣质阿胶、杂皮胶、黄明胶(牛皮胶)等冒充正品阿胶的事件屡见不鲜,给阿胶的真伪鉴别及质量控制提出了新的挑战。阿胶的传统鉴别方法主要为性状鉴别(颜色、气味、形状、口感、质地等)和理化鉴别(火试、水试等)。随着科学技术的不断发展,越来越多的分析仪器被应用于阿胶的质量控制研究,使阿胶的质量控制标准更加科学合理。1胶原蛋白等物质的测定阿胶的组成部分既有大分子的蛋白质,又有小分子氨基酸和无机盐,也有不溶性物质。大量研究表明阿胶由蛋白质、多肽、氨基酸、硫酸皮肤素、透明质酸、生物碱以及多种微量元素组成。阿胶是由胶原蛋白等物质的水解产物组成,因此其主要成分是蛋白质,含量约为60%~80%,凝胶电泳结果表明阿胶中主要蛋白质的等电点集中在4.6~4.8,分子量在2~24万均有分布。阿胶中的氨基酸也是来自胶原蛋白的水解,共十七种(包括人体必需七种氨基酸),含量以甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸和精氨酸为主要氨基酸,均占总氨基酸含量的7.0%以上,阿胶中含有国际上公认的对人体有益的全部16种微量元素,主要有钾、钠、钙、镁、铁、铜、铝、锰、锌、铬、铂、钼、锶等,阿胶的许多药理作用都与它们有关。针对阿胶的组成,研究人员从不同的方面建立研究方法。2蛋白质含量的测定半透膜透析是一种可逆的动态平衡,平衡时膜内外两边的渗透压相等,是蛋白类药物研究的最基本方法。如葛正华利用半透膜渗析法分离阿胶中的蛋白及小分子物质,以已知质量的滤纸过滤半透膜中的液体,烘干滤纸得不溶物的质量,并通过Langmuir方程外推法确定可以渗析出的小分子物质全部量,从而确定蛋白质的含量。刘颖等采用分级过滤法,其原理归结于半透膜渗析法,分离出阿胶的有效成分进行测定,结果表明阿胶中的蛋白质含量在60%以上。同时该实验采用毛细管粘度计测定纯水的粘度和定容后胶液的粘度,用“一点法”确定胶液的特性粘度,从而计算出蛋白类的粘均分子量在22~24kD。3蛋白质及多肽的稳定性随着蛋白质组学的诞生及发展,阿胶中蛋白质的研究也随之进入了新的阶段。王若飞等人就从蛋白质组学的角度对阿胶中所含的蛋白质及多肽进行了研究,试验过程中以硫酸铵沉淀、透析脱盐冻干法获得阿胶中的水溶性蛋白及多肽,采用CiphergenBiosystemsInc.ProteinChipBiologySystem(美国PBSⅡ+)及配套的NP10芯片、激光解析/离子化-飞行时间质谱技术,分析阿胶Mr1500~13000区间蛋白质、肽分布及其相对分子质量。测定四个不同质量浓度的样品,稳定获得的有意义蛋白及多肽共计9个。不同相对分子质量肽之间差为71.7,88.4,148.9,分别提示可能为丙氨酸残基(Mr71.08)、丝氨酸残基(Mr87.08)、苯丙氨酸残基(Mr147.18)的相对分子质量。4动物胶的种类蛋白质作为阿胶的重要药效成分,也是为阿胶区别于其它动物胶的特征成分之一。如李锋等以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴别阿胶、鹿角胶、龟板胶、鳖甲胶、海龙胶、杂皮胶、鱼鳞胶七种动物胶,不同来源的胶类药材电泳图谱明显不同,尤其是常充阿胶的杂皮胶与正品阿胶相比,不仅谱带数目少,而且泳动率差异也较大。其它几种胶虽有1条或2条相近的谱带,但尚有各自特征的鉴别谱带。5氨基酸的测定《中国药典》2005年版(一部)中增加了薄层色谱鉴别项,以甘氨酸为对照品鉴别阿胶水解得到的甘氨酸。赵曦等通过比较测定30种阿胶,发现按《中国药典》1995年版一部(附录ⅨL)测定阿胶及伪品胶的总氮量无显著性差异,而采用酸碱滴定法测定结果显示阿胶中的氨基氮含量远高于伪品中的含量。因此,实验者提示以氨基氮含量>0.6%来控制阿胶的质量。6氨基酸的分离王晓坤等人对阿胶水溶性成份进行了HPLC分析,以萃取的方法提取阿胶中的水溶性成份,水-乙腈梯度洗脱,经C18色谱柱分离出28个共有峰,液-质联用分析确定了5个成分分别为游离的异亮氨酸,亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸。阿胶系由胶原水解得到的胶原蛋白及多种氨基酸。阿胶中游离的氨基酸含量较少,而胶原蛋白水解后可得到18种氨基酸(包括7种人体必需氨基酸),且含量相对较高。因此,不少研究人员将研究重点放在了蛋白水解后得到的氨基酸上。鄢丹等反相高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定阿胶中的17种未衍生氨基酸,采用PrevailC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),以乙腈-0.7%三氟醋酸溶液(含5.0mmol·L-1七氟丁酸)为流动相进行线性梯度洗脱,流速为0.8mL·min-1,在漂移管温度115℃、氮气流量2.5L·min-1条件下,25min内即可完成对阿胶中17种氨基酸的分离测定。该研究对阿胶中氨基酸的组成及含量进行了分析,分离测定了17种氨基酸的含量,其总含量大于50%。7氨基酸及硫酸皮肤素的含量及其组成生物体内的微量元素是指含量占生物体总质量0.01%以下的元素。微量元素在人体内的含量虽少,但在生命活动中的作用却是十分重要的。随着实验研究的深入和分析手段的提高,人们逐渐认识到中药发挥疗效的物质基础除了有机成分外,微量元素也是其重要有效成分之一。因此,中药微量元素的测定和鉴别至关重要。黄必胜采用原子吸收光谱法测定了阿胶、龟板胶、鹿角胶三种胶种Zn,Cu,Fe,Mn四种元素的含量。样品处理方法采用干灰化法,用高纯盐酸溶解残渣,高纯水稀释,定容,测定各样品的原子吸收光谱。中医理论认为人的气、血、精液与元素Zn,Cu,Fe,Mn的关系较大。三种胶的测定结果表明,阿胶中铁的含量最高,与其补血的功效一致。王文静等以X射线荧光光谱法测定了6个产地的阿胶中微量元素(元素测定范围B~U)的含量。其中三种与对照品的元素特征谱基本一致,而另外两种阿胶中含有的Cr,Cl,Na和K远高于对照品中四种元素的含量,实验者认为出现该现象的原因可能是在熬制阿胶过程中掺入制革的碎杂皮所引入的。硫酸皮肤素是一类结构复杂、硫酸化的糖胺聚糖,除了具有抗血栓作用外,还具有抗炎症、抗肿瘤、抗感染和损伤修复等作用。现代研究认为阿胶中除了含有蛋白质、多肽、氨基酸、微量元素外,还含有具有多种药理作用的硫酸皮肤素。90年代初期,樊给曾等人就关注过阿胶中硫酸皮肤素的研究。该实验同时鉴别和测定了阿胶及驴皮中的硫酸皮肤素及其含量,试验采用酶解的方法获得硫酸皮肤素,以电泳法对其进行鉴别。酶解液经染料天青I染色后,采用分光光度法在536nm处测其吸收度,进而计算含量。随着计算机软件技术的发展,科研工作者开发了多种用于中药分析的统计软件,这使得中药的分析更加科学合理。目前,运用于中药图谱分析的统计软件主要包括SAS、Stata和SPSS、MATLAB及中药色谱指纹图谱相似度评价系统等,主要应用的模式识别方式包括聚类分析、主成分分析、距离判别分析、相似度分析、神经网络等。近几年,从事阿胶鉴别及质量控制的研究人员,将这些软件技术引入到阿胶的研究中,取得了一定的成果。屈凌波等采用模糊神经网络处理阿胶的识别,提取10个圆二色光谱谱图特征及1个旋光度数据,所得到的结果是样本对于某类的隶属度,可以将混合样本进行科学的归属,对于可能存在的混合样本进行正确的评价。结果表明网络训练后能把一些混合胶样品隶属于何种胶的隶属度识别出来,从而确定混合胶的归属。瞿海斌等采用近红外漫反射光谱法结合主成分分析、NIR光谱相似度匹配法、主成分得分马氏距离法鉴别阿胶真伪。对经预处理后的阿胶NIR谱图进行主成分分析,8个真品阿胶聚集在某个范围内,表明其产品质量比较稳定。而伪品阿胶散落在圈定的范围之外,表明真伪品阿胶之间存在着明显的差异。8制约胶质管理体系的研究阿胶作为一种有着几千年用药史的传统中药,其药效在国内已得到了广泛的认可,经济效益不可小觑。如何让阿胶走出国门,打入