20222022学年高中生物选修一最新同步教学2

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课题背景尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。但尿素不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨后才能被植物利用。细菌能利用尿素的原因土壤中的细菌之所以能分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3NH3不能直接吸收，植物吸收其中的N是以NH4和NO3-形式吸收的。NH3的水溶性高，在水中形成NH4；土壤里的微生物如硝化细菌把NH3氧化为NO3-，然后以NO3-的形式被植物吸收。常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌研究思路（一）筛选菌株（二）统计菌落数目（三）设置对照课题背景启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。PCR技术是一种常用的DNA扩增技术，此项技术的自动化，需要使用耐高温的DNA聚合酶，如果请你来找这种耐高温的酶，你会去哪里找？热泉70-80摄氏度的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而耐热的Taq细菌脱颖而出。水生耐热细菌Taq（一）筛选菌株4一、研究思路1、实验室微生物的筛选原理人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。（一）筛选菌株2、选择培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。加入青霉素的培养基——细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长5一、研究思路（1）在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是是什么物质？碳源是葡萄糖和尿素，氮源是尿素（2）分析该配方的培养基对微生物是否具有选择作用？如果有，又是如何进行选择的？有筛选作用。尿素是培养基中的唯一氮源，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。3、分离尿素分解菌的选择培养基（一）筛选菌株6一、研究思路1mm（二）统计菌落数目1、显微镜直接计数法①不能区分死菌与活菌；②不适于对运动细菌的计数；③个体小的细菌在显微镜下难以观察缺点7一、研究思路利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。a不能区分死菌与活菌；b不适于对运动细菌的计数；c需要相对高的细菌浓度；d个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点一、研究思路（二）统计菌落数目1、显微镜直接计数法一、研究思路2、活菌计数法——统计菌落数目（稀释涂布平板法）（二）统计菌落数目9一、研究思路3稀释涂布平板法在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。原理：恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30～300的平板进行计数。一、研究思路（二）统计菌落数目每克样品中的菌落数＝C÷V×MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积ml，M代表稀释倍数。2稀释涂布平板法一、研究思路（二）统计菌落数目①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低？注意事项当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。一、研究思路排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。二、研究思路设置对照的主要目的是：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。原因：⑴土样不同，⑵培养基污染或操作失误或者是混入了其他的含氮物质实例：一、研究思路（三）设置对照小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。一、研究思路（三）设置对照（一）土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。（二）制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。二、实验设计

由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。

准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基（作对照）。还需要8个灭菌试管和1个灭菌移液管。

将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。（三）、样品的稀释二、实验设计◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行◆分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板二、实验设计（三）、样品的稀释注意：实验时要对培养皿作好标记注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。如果得到了2个或2个以上菌落数目在30—300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大表明试验不精确，需要重新实验。（四）、取样涂布二、实验设计注意事项——实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养日期、稀释度等。三、实验操作注意事项（四）、取样涂布高浓度→低浓度，换枪头低浓度→高浓度，可不用换枪头三、实验操作注意事项（四）、取样涂布三、实验操作注意事项如果得到了2个或2个以上菌落数目在30—300的平板，则说明稀释操作比较成功，可以对菌落进行计数。记细菌：30～37℃；1～2d霉菌：25～28℃；3～4d放线菌：25～28℃；5～7d

1培养：2观察与计数：一般来说，在一定的培养条件下相同的培养基、温度及培养时间，同种微生物表现出稳定的菌落特征。记（五）、培养和观察在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。微生物的培养与观察1、结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。2、是否获得了某一稀释度下，菌落数目在30——300的平板。在这稀释度下，是否至少有两个平板的菌落数相近？3、你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？24四、结果分析与评价土样涂布在选择培养基分解尿素的细菌菌落鉴别培养基分解尿素的细菌鉴定分解尿素的菌体能合成脲酶，可将尿素分解为氨。氨会使培养基的碱性增强，PH升高。通过检测培养基的PH变化来判断。理解在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。记五、课题延伸在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素本课题只是对能分解尿素的细菌进行了初步的筛选，只是分离纯化菌种的第一步。对分离的菌种作进一步的鉴定，要借助生物化学的方法。CONH22H2OCO22NH3脲酶原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红五、课题延伸大肠杆菌呈深紫色,中心有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂EMB上典型特征【课堂小结】一、分离--选择培养基的：分解尿素细菌的分离与计数尿素作为唯一的氮源。二、鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素。三、统计菌落数目的方法（1）显微镜直接计数法（2）间接计数法（稀释涂布平板计数法）①计算公式每克样品中的菌株数＝C÷V×M②操作：设置重复组，选择菌落数30～300的平板进行计数。四、设置对照①证明培养基未被污染---用空白培养基作对照（选择培养基不接种土壤样品）。②证明选择培养基的选择作用--对照组（牛肉膏蛋白胨培养基接种等量同种菌液）1、下列能选择出分解尿素细菌的培养基是AH2PO4、Na2HPO4、、葡萄糖、尿素、琼脂、水BH2PO4、Na2HPO4、、葡萄糖、琼脂、水CH2PO4、Na2HPO4、、尿素、琼脂、水DH2PO4、Na2HPO4、、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水1、下列能选择出分解尿素细菌的培养基是AH2PO4、Na2HPO4、、葡萄糖、尿素、琼脂、水BH2PO4、Na2HPO4、、葡萄糖、琼脂、水CH2PO4、Na2HPO4、、尿素、琼脂、水DH2PO4、Na2HPO4、、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水A课后练习：2、下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是（）A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B取104、105、，分别涂布于各组平板上C将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24-48小时D确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数D2、下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是（）A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B取104、105、，分别涂布于各组平板上C将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24-48小时D确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数3、用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是A未接种的选择培养基B未接种的牛肉膏蛋白胨培养基C接种了的选择培养基D接种了的牛肉膏蛋白胨培养基4、在本课题的实验中，下列关于土壤取样的叙述，错误的是（）A土壤取样时应选取肥沃、湿润的土壤左右，再取样C取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌D应在火焰旁边称取土壤DC课后练习：4能够测定样品活菌数的方法是A稀释涂布平板法B直接计数法C重量法D比浊法5下列关于微生物分离和培养的叙述,错误的是A微生物培养前,需对培养基进行消毒B测定土壤样品中的细菌数目,常用菌落计数法C分离土壤中不同的微生物,要采用不同的稀释度D分离能分解尿素的细菌,要以尿素作为培养基中唯一的氮源AA课后练习：6、牛等牲畜的瘤胃中生活着许多以尿素作唯一氮源的微生物。某同学从刚宰杀的牛的瘤胃中取样获得菌液，并对能分解尿素的细菌进行分离、计数和鉴定。回答下列问题：（1