酵母发酵力测定试验步骤

酵母发酵力的测定一、 目的通过测定酵母发酵力，筛选发酵力强的酵母。二、 实验原理酵母在微酸性糖液中起发酵作用，其中的糖逐渐减少，乙醇及CO2则依比例而增大，CO2是气体，除溶解于醪中者外，都跑向外面，所以测定酵母的发酵力，或测糖液比重的减小，或测糖的减少，或乙醇的增加，或称培器为减轻量，以CO2的失去多少，或用NaOH等固定CO2然后称其量，或将培养器密闭，由其中压力的增大，而定发酵的强弱等。本实验采用乙醇浓度增大、co2含量、糖的减少、培养器的减轻四个方面测定其发酵力强弱。三、 实验材料菌种：本公司实验室分离所得。试剂：葡萄糖、果糖、蔗糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、蛋白胨、酵母浸膏、菲林试剂、碳酸氢钠。器具：大三角瓶、小三角瓶、胶塞、玻璃管、1ml移液管、10ml移液管、天平、酒精计、温度计、蒸馏器、培养箱。培养基四、 方法步骤从斜面菌种接种到小三角瓶（100ml培养基）28°C培养24h；摇匀小三角瓶菌种，吸取10ml接种到大三角（1000ml），装好CO2收集装置，称重，记录其重量，置28C培养，每天称重一次，直到重量减少量小于0.5g；发酵结束后，通过测量排水量测定CO含量；2取一定量的发酵醪液，测定其残糖量，以测定其发酵力；取100ml发酵醪液，加100ml水蒸馏出100ml溶液，用酒精计测定其乙醇含量。（注：如果用酒精计不能测出，则改用重铭酸比色法或气相色谱法）重铭酸比色法所需试剂如下：0.1%(v/v)标准乙醇溶液；(2)2%重铭酸钾溶液；(3)浓硫酸；铭酸比色法酒精糟中微量乙醇的测定酒精糟中乙醇的含量是蒸馏时的一个重要指标。但酒精糟中乙醇含量甚微，不宜采用酒精计测量，需用比色法测定，比色法测定乙醇其浓度下限可达0.02%。1、 原理酒精糟中残余乙醇的测定采用蒸馏法，蒸出的乙醇用重铬酸钾氧化为乙酸，而六价铬被还原为三价铬，以比色法测定。3CHCHOH+2KCrO+8HSO=3CHCOOH+2Cr(SO)+2KSO+1乙 乙 / 乙 I 乙 I 乙 I1H2O2、 试剂0.1%(v/v)标准乙醇溶液(2)2%重铬酸钾溶液(3)浓硫酸3、 测定步骤(1)标准系列管的制备在10毫升比色管中，按下列加入各溶液编号0123450.1%(v/v)标准乙醇溶液(毫升)012345水(毫升)543210各管中加1毫升重铬酸钾溶液，5毫升浓硫酸，摇匀。于沸水浴中加热10分钟，取出冷却。（2） 试样管的制备称取100克酒精，放入500毫升圆底烧瓶中，加200毫升水，蒸馏，用100毫升容量瓶正确接收馏出液100毫升，摇匀。取5毫升馏出液，放入10毫升比色管中，加1毫升2%重铬酸钾溶液，5毫升浓硫酸，摇匀，与标准系列管一起于沸水浴中加热10分钟，取出冷却。（3） 目视比色将试样管与标准系列管比较色泽，求得酒精糟中乙醇含量：乙醇（毫升/100克）=Vx0.001x100/5式中V-试样管与标准系列管色泽相当的标准管中标准乙醇溶液的体积（毫升）0.001-标准乙醇溶液的体积（毫升/毫升）5-所取馏出液的体积（毫升）100-馏出液的总体积（毫升）（4） 分光光度计法在600纳米波长下测光密度，绘制标准曲线，从标准曲线上求得试样管光密度所对应的0.1%的标准乙醇溶液的体积（V），按目视比色法测定。酵母菌常用培养基（1） 菌体生产培养基：葡萄糖150g，硫酸镁0.1g，酵母膏15g,硫酸铵5g,磷酸二氢钾8g,硫酸亚铁0.1g，加水至1000ml，pH4.1〜4.5；（2） 菌体补料培养基：葡萄糖500g，硫酸镁10g，酵母膏15g，硫酸铵30g，磷酸二氢钾15g，硫酸亚铁0.2g，加水至1000ml，pH4.1〜4.5；（3） 发酵培养基：葡萄糖600g，硫酸镁4g，酵母膏6g，硫酸铵6g，磷酸二氢钾2g，加水至1000ml，pH4.1〜4.5；（4） YEPD培养基（用于酵母原生质体融合）：酵母浸膏10g,蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL,pH6.0,115°C湿热灭菌20min。（5） 芽汁琼脂培麦养基成分：优质大麦或小麦，蒸馏水，碘液。制法：取优质大麦或小麦若干，浸泡6〜12h，置于深约2cm的木盘上摊平，上盖纱布，每日早、中、晚各淋水一次，麦根伸长至麦粒两倍时，停止发芽晾干或烘干。称取300g麦芽磨碎，加1000mL水，38C保温2h，再升温至45C，30min，再提高到50C，30min，再升至60C，糖化1〜1.5h。取糖化液少许，加碘液1〜2滴，如不为蓝色，说明糖化完毕，用文火煮半小时，四层纱布过滤。如滤液不清，可用一个鸡蛋清加水约20mL调匀，打至起沫，倒入糖化液中搅拌煮沸再过滤，即可得澄清麦芽汁。用波美计检测糖化液浓度，加水稀释至10倍，调pH5〜6，用于酵母菌培养；稀释至5〜6倍，调pH7.2，可用于培养细菌，121°C灭菌20min。（6） 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）成分：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖（或蔗糖）20g，琼脂20g，水1000mL。制法：pH值自然。将马铃薯去皮、洗净、切成小块，称取200g加入1000mL蒸馏水，煮沸20min，用纱布过滤，滤液补足水至1000mL，再加入糖和琼脂，溶化后分装，121C灭菌20min。另外，用少量乙醇溶解0.1g氯霉素，加入1000mL培养基中，分装灭菌后可用于食品中霉菌和酵母菌计数、分离。（7） 米曲汁培养基制法：取150g大米于1000ml三角瓶中，用水洗三次，沥干，加入水150g，常压蒸熟，待米饭冷却到28〜35C时，接种适量（参考用量：一支斜面）糖化力强的根霉种，培养46〜48h，接水（水温70C以上）300ml，静置4h以上，用纱布过滤，即制成米曲汁。根据培养条件，调节pH值及其他元素，即可。一般用于培养酵母和霉菌。（例如：培养霉菌及酵母，pH值一般调至4.5〜5.0，同时需加入0.1%磷酸二氢钾及0.05%的硫酸镁）还原糖的测定：菲林试剂法原理：菲林试剂由甲液、乙液组成，甲液为硫酸铜溶液，乙液为酒石酸钾钠和氢氧化钠溶液。两液分别贮存，使用时等体积混合。甲液、乙液一经混合，先生成氢氧化铜沉淀，进一步与酒石酸钾钠反应，是沉淀溶解生成酒石酸钾钠铜络合物，络合物中的二价铜是氧化剂，使还原糖中的的羰基氧化，自身则还原生成氧化铜沉淀，反应终点用亚甲基蓝指示剂显示。亚甲基蓝也是氧化剂，但其氧化能力比二价铜弱，待二价铜反应完毕，过量1滴还原糖，立即使亚甲基蓝还原，蓝色消失为终点。试剂配制：（1） 菲林试剂的配制：甲液：称取硫酸铜（CuSO4・5H2O）69.3g溶于水并稀释至1L。乙液：称取酒石酸钾钠（C4O6H2KNa・4H2O）346g，氢氧化钠（NaOH）100g，溶于水并稀释至1L。（2） 2g/L葡萄糖标准溶液：准确称取于100〜105C烘2h并在干燥器中冷却的无水葡萄糖2g（准确到0.0002g），溶于水，加5ml浓盐酸（抑制细菌生长，可不加），用水定容至1L。（一般贮存在冰箱内，不能存放太久，存放一周后需重配）（3） 10g/L亚甲基蓝指示剂：1g亚甲基蓝于100ml水中温热溶解。3.测定步骤（注意：菲林试剂必须现配现用！）（1） 菲林试剂标定：准确吸取菲林甲液、乙液各5ml于250ml三角瓶中，加水约20ml，加入2滴亚甲基蓝指示剂，用滴定管加入约24ml2g/L葡萄糖标准溶液，摇匀，微沸2min后，继续用2g/L葡萄糖标准溶液滴定到蓝色消失为终点。最后的滴定操作应控制在1min完成。消耗糖液总量为V（ml）。即可求出10ml菲林试剂相当于标准葡萄糖的克数（F）。F=VXC（2） 糖液滴定：a，预滴定：准确