生物化学与分子生物学实验：PCR技术检测β-actin基因

PCR——PCR技术检测β-actin基因前言一滴残留在裙子上的精液使得美国总统BillClinton不得不坦承他与白宫实习生有不正当的关系。因为他知道现在的生物科技就连一个精子也能被用来做为证据。这种将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术正是PCR具有的特色之一。这也是分子生物医学令人震撼的一例。什么是PCRPCR：聚合酶链锁反应，Polymerasechainreaction扩增特定的DNA片段在生物体外进行β-actin基因β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富PCR技术的历史与发展DNA聚合酶（DNApolymeraseI）最早于1955年发现E.Coli片段则是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应现今所使用的酶(简称Taq酶),则是于1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温PCR技术的历史与发展1971年由Dr.KjellKleppe发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验PCR技术的历史与发展而今所发展出来的PCR技术是1983年由凯利·穆利斯(KaryMullis)发明，并因此在七年之后，1993年10月，获得了诺贝尔化学奖该项殊荣。穆利斯的想法是，利用一种人工方法，和反复相同程序的方法，并利用一种特殊的酶——即DNA聚合酶来扩增特定的DNA片段。PCR原理模板DNA、引物、4种dNTP存在的情况下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段DNA片段来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA中的一段互补序列（即我们要检测的序列）结合，形成双链引物的选择选择引物的长度和熔点(Tm)要考虑许多条件，现有程序专门设计引物的软件GC所占比例为40％－60％计算两个引物的Tm，使之不相差5℃，并且扩增产物的Tm与引物的相差不超过10℃。黏合温度通常比计算的最低Tm低5℃，但是要根据经验为不同条件下的PCR选择不同的黏合温度。内部的具有自身互补性的发卡结构不超过4个，其二聚体中不超过8个。3'末端尤其重要，必须不含有与其他引物互补的序列，并且要与模板完全互补。PCR反应的基本过程变性→退火→延伸PCR简图(1)96℃高温下使双股DNA打开(2)在约68℃下让引子与DNA配对

(3)在72℃DNA延长(P=聚合酶).(4)第一循环完成，做出的两段双股DNA又可当作下一个循环模板，这样每次循环都使得扩增的DNA片段加倍。实验器具与材料移液枪：200μl、10μl吸头：200μl、20μlEP管（微型离心管）：1.5ml、100μl实验步骤准备100μlEP管依次在管中加入（50μl反应体系）：

(ddH2O37.5μl

10mmol/LdNTP1μl

10×PCR缓冲液5μl

25mmol/LMgCl2（加之前要摇匀）3μl

引物)已加好

模板cDNA3μl

实验步骤离心10000rpm×10s100℃沸水浴1min趁热加入Taq酶0.5μl（冰上操作）再加入50μl液状石蜡封闭离心10000rpm×1min放入PCR仪器中实验步骤离心10000rpm×5min将下层水相转入新的EP管中，进行下一项实验PCR技术最新进展递减PCR、逆转录PCR(RT-PCR)、热启动PCR、即时PCR…逆转录PCR