蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有1.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器研钵等。2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。3.反复冻融法>生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。4.超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。5.酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。（二） 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得#选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。3.有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。（四）样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。卵清蛋白分离提取及纯化的具体试验步骤一、实验目的与原理鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中较不稳定。由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白做亲和配基配制纯化胰酶的亲和材料。二、材料与试剂：1．材料：新鲜鸡蛋2只2：仪器：抽滤瓶500—1000ml、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器3：试剂：10%TCA,用固体NaOH调调PH至一，需要50ml、5NHCL、5NNaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、，缓冲液（每ml含和），50ml,Tris-HCL缓冲液三、操作步骤取两只新鲜鸡蛋，得蛋清50ml，置于烧杯中，外用温水浴25^—30^，在不断搅拌条件下，缓慢加入等体积得三氯乙酸一丙酮（1：2V/V）,立即出现大量白色絮状沉淀，加完后最终PH约，再继续搅拌30min，然后在41冰箱中放置过夜。次日用布氏漏斗抽滤，得黄绿色清液。边搅拌边加入41预冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在41放置2h之后将上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于4000rpm离心5min，收集沉淀。4,将沉淀溶于10ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4h，换水两次，再对碳酸钠缓冲液透析过夜，4000rpm离心10min,去除不溶物。抗菌蛋白分纯的步骤准备试剂：异丙醇含盐酸胍的95%乙醇无水乙醇1%SDS。操作步骤：1•取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1mlTRIzol加异丙醇，室温放置10分钟，2〜8^12000Xg离心10分钟弃上清。2.用含盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2〜8°C7500Xg离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。3•真空抽干蛋白质沉淀5〜10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50C温浴使其完全溶解，不溶物2〜8C10000Xg离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于WesternBlot或-5至-20C保存备用。注意事项1.蛋白质沉淀可保存在含盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2〜8C—个月以上或-5至-20C—年以上。$2.用％SDS在2〜8C透析三次，10000Xg离心10分钟取上清即可用于WesternBlot。常见问题分析：得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底。 B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解。蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻。电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分。Y球蛋白分离，纯化，鉴定的方法（包括原理，步骤，预期结果，注意事项）［原理］血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、al-球蛋白、a2-球蛋白、B-球蛋白和Y-球蛋白，其中Y-球蛋白含量约占16%,100ml血清中约含左右。首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中（常用硫酸铵）溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离，沉淀部分即为含有Y-球蛋白的粗制品。 用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等。本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离°a—球蛋白、B-球蛋白的PI〈；Y—球蛋白的PI为左右。因此在的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。经DEAE（二乙基氨基乙基）纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的a—球蛋白和B-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合;带正电荷的Y—球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。因此随洗脱液流出的只有Y—球蛋白，从而使Y—球蛋白粗制品被纯化。其反应式如下：用上述方法分离得到Y—球蛋白是否纯净,单一可将纯化前后的Y—球蛋白进行电泳比较而鉴定之。［操作］1）-盐析一一中性盐沉淀：取正常人血清于小试管中，加％氯化钠溶液，边搅拌混匀边缓慢2）滴加饱和硫酸铵溶液乙，混匀后于室温中放置10min,3000r/min离心10min。小心倾去含有清蛋白的上清液，重复洗涤一次，于沉淀中加入/L磷酸盐缓冲液〜使之溶解。此液即为粗提的Y—球蛋白溶液。3） （2）脱盐凝胶柱层析 ①装柱洗净的层析柱保持垂直位置，关闭出口，柱内留下约洗脱液。一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内，打开柱底部出口，调节流速min。凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部，最后使凝胶床达20厘米高，床面上保持有洗脱液，操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现“纹路”。在凝胶表面可盖一园形滤纸，以免加入液体时冲起胶粒。②上样与洗脱：可以在凝胶表面上加圆形尼龙滤布或滤纸使表面平整，小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面，关紧下端出口，用长滴管吸取盐析球蛋白溶液，小心缓慢加到凝胶床表面。打开下端出口，将流速控制在min使样品进入凝胶床内。关闭出口，小心加入少量L磷酸盐缓冲液洗柱内壁。打开下端出口，待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。如此重复三次，以洗净内壁上的样品溶液。然后可加入适量缓冲液开始洗脱。加样开始应立即收集洗脱液。洗脱时接通蠕动泵，流速为min,用部分收集器收集，每管1ml。③洗脱液中NH4+与蛋白质的检查：取比色板两个（其中一个为黑色背底），按洗脱液的顺序每管取一滴，分别滴入比色板中，前者加20%磺基水杨酸溶液2滴，出现白色混浊或沉淀即示有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度；于另一比色板中，加人奈氏试剂应用液l滴，以观察NH4+出现的情况。合并球蛋白含量高的各管，混匀。除留少量作电泳鉴定外，其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化。纯化一一DEAE纤维素阴离子交换层析：用DEAE纤维素装柱约8-10cm髙度，并用/L磷酸盐缓冲液平衡，然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱、分管收集。用20％磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况。(装柱、上样、洗脱，收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析)。》浓缩一一经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的Y—球蛋白液往往浓度较低。为便于鉴定，常需浓缩。收集较浓的纯化的Y—球蛋白溶液2ml,按每ml加〜G一25干胶，摇动2〜3min,3000r/min离心5min。上清液即为浓缩的Y-球蛋白溶液。鉴定一一乙酸纤维素薄膜电泳取乙酸纤维素薄膜2条，分别将血清、脱盐后的球蛋白、DEAE纤维素阴离子交换柱纯化的Y-球蛋白液等样品点上。然后参阅实验二十四：乙酸纤维薄膜电泳法进行电泳分离、染色。比较电泳结果。［注意事项］凝胶及DEAE纤维处理期间，必须小心用倾泻法除去细小颗粒。这样可使凝胶及纤维素颗粒大小均匀，流速稳定，分离效果好。装柱是层析操作中最重要的一步。为使柱床装得均匀，务必做到凝胶悬液或DEAE纤维素混悬液不稀不厚，一般浓度为l：l,进样及洗脱时切勿使床面暴露在空气中，不然柱床会出现气泡或分层现象；加样时必须均匀，切勿搅动床面，否则均会影响分离效果。本法是利用Y-球蛋白的等电点与a-、B-球蛋白不同，用离子交换层析法进行分离的。因此层析过程中用的缓冲液pH要求精确。电泳注意事项见实验二十四。凝胶贮存：凝胶使用后如短期不用，为防止凝胶发霉可加防腐剂如％叠氮钠。保存于41冰箱内。若长期不用，应脱水干燥保存。脱水方法：将膨胀凝胶用水洗净。用多孔漏斗抽干后，逐次更换由稀到浓的乙醇溶液浸泡若干时间，最后一次用95％乙醇溶液浸泡脱水，然后用多孔漏斗抽干后，于60〜80^烘干贮存。离子交换剂的再生和保存；离子交换剂的价格较贵，每次用后只需再生处理便能反复使用多次。处理方法是：交替用酸、碱处理，最后用水洗至接近中性。阳离子交换剂最后为Na型，阴离子以Cl型是最稳定型，故阴离子交换剂处理顺序为碱一水一酸一水。由于上述交换剂都是糖链结构。容易水解破坏，因此须避免强酸、强碱长时间浸泡和髙温处理，一般纤维素浸泡时间为3-4h。 离子交换剂容易长霉引起变质，不用时，需洗涤干净，加防腐剂置冰箱内保存。常用％叠氮钠防腐。叠氮钠遇酸放出有毒气体，也是剧毒与易爆的危险品。使用时要加倍小心。除用凝胶层析法去除无机盐类外，最常用的去盐法就是透析。细的透析袋效率髙，所需时间短。将透析袋一端折叠，用橡皮筋结扎，试验是否逸漏，然后倒入待透析的蛋白质溶液。勿装太满，将袋的上端也结扎好，即可进行透析。开始可用流动的自来水，待大部分盐被透析出后，再改为生理盐水、缓冲液或蒸馏水。透析最好在较低的温度下，并在磁力搅拌器上进行。此法简单，易操作，仪器及试剂要求不髙，但不如凝胶层析法效率髙。浓缩Y-球蛋白粗提液除上述方法外还可用透析袋浓缩。将待浓缩的蛋白质溶液放入较细的透析袋中，置入搪瓷盘内。透析袋周围可撒上聚乙二醇6000(PEG6000)，或聚乙烯吡咯酮，或蔗糖。以上物质在使用后(吸了大量水)都可以通过加温及吹风而回收；将装有蛋白质溶液的透析袋悬挂起来，用电风扇髙速吹风(io°c以下)，也可达到浓缩目的，以上两法虽不如SephadexG一25干胶快，但价格较便宜，方法也不烦琐。［试剂］(1)饱和硫酸铵溶液：称固体硫酸铵(分析纯)850g，置于1000ml蒸馏水中，在70一80C水温中搅拌溶解。将酸度调节至，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。(2)葡聚糖凝胶G一25的处理：按每100ml凝胶床体积需要葡聚糖凝胶G—25干胶25g。称取所需量置于锥形瓶中。每克干胶加入蒸馏水约30ml，用玻璃棒轻轻混匀，置于90〜100C水温中时时搅动，使气泡逸出。1h后取出，稍静置，倾去上清液细粒。也可于室温中浸泡24h，搅拌后稍静置，倾去上清液细粒，用蒸馏水洗涤2〜3次，然后加L磷酸盐缓冲液平衡，备用。(3)DEAE—32(二乙基氨基乙基一32)纤维素的处理：按100ml柱床体积需DEAE纤维素14g称取，每克加/L盐酸溶液15ml，搅拌。放置30min(盐酸处理时间不可太长，否则DEAE纤维素变质)。加约l0倍量的蒸馏水搅拌，放置片刻，待纤维素下沉后，倾弃含细微悬浮物的上层液。如此反复数次。静置30min，虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，直至上清液pH〉4为止。加等体积lmol/L氢氧化钠溶液，使最终浓度约为L氢氧化钠，搅拌后放置30min，以虹吸除去上层液体。同上用蒸馏水反复洗至pH<7为止。虹吸去除上层液体，然后加入L磷酸盐缓冲液平衡，备用。(4)/L磷酸盐缓冲液A液：称取磷酸二氢钠溶于蒸馏水中，加蒸馏水稀释至1000ml。B液：称取磷酸氢二钠，溶于蒸馏水中，加蒸