重度牙周炎病人中性多形核白细胞分泌功能及急性期纤维蛋白原的影响

重度牙周炎病人中性多形核白细胞分泌功能及急性期纤维蛋白原的影响

中立多形核细胞（pmn）是牙齿组主要的免疫细胞，在预防螺母疾病方面发挥着重要作用。但PMN清除感染微生物的同时产生和释放的氧自由基、蛋白酶、促炎细胞因子以及前列腺素等具有强烈的促炎症反应和组织破坏作用。研究显示:侵袭性和重度慢性牙周炎病人PMN或单核细胞可对一些刺激产生异常强烈的炎症反应、释放高水平促炎细胞因子等炎性介质,即具有“过度炎症反应特征(hyper-reactiveinflammatoryresponsetrait)”。研究表明:严重的牙周感染、炎症可导致机体急性期反应,使急性期纤维蛋白原(fibrinogen,Fg)水平升高而影响冠心病(coronaryheartdisease,CHD)的发生;并且Fg可促进牙龈卟啉单胞菌对人口腔上皮的黏附、定植、还可通过促进白细胞分泌促炎细胞因子而加重组织炎症反应,可能是牙周炎与CHD相关的物质基础。本研究分析Fg对不同牙周状态者外周血PMN分泌促炎细胞因子IL-1β、IL-8的影响,探讨PMN功能和Fg在炎症反应中的作用。1材料和方法1.1elisa法中性粒细胞分离液PolymorphprepTM(AXIS-SHIELD,挪威);IL-1β和IL-8ELISA试剂盒(R&D,美国);纯化人Fg(Sigma,美国);趋化性甲酰三肽fMLP(Fluka,美国);TECAN全自动ELISA工作站(SAFIRE,澳大利亚)。1.2方法1.2.1临床附着丧失选取牙周健康、重度牙周炎志愿者各4人,年龄45～52岁,要求:全身健康,无全身性疾病、无吸烟史。牙周健康组定义为:牙龈无炎症、出血,无牙周袋形成、附着丧失;重度牙周炎组定义为:全口平均临床附着丧失(clinicalattachmentloss,CAL)≥2.5mm,邻面CAL≥5mm的位点数≥3,且分布于3个不同的区段,非牙周炎失牙数≤14。研究对象来自四川大学华西口腔医院牙周科门诊,均知情同意。1.2.2pmn分离纯化分别抽取各受试对象前臂肘前静脉血10mL,加入肝素钠抗凝管,采用Polymorphprep梯度密度离心法分离PMN,分别混匀后进行细胞计数并调节细胞悬液密度。取PMN悬液少量涂片、Wright-Giemsa染色,证实分离所得PMN纯度>95%;2%台盼蓝排斥试验证实活细胞率为95%～98%(图1～2)。1.2.3趋化肽fmlp配制人Fg液并以终浓度2mg/mL加入24孔细胞培养板作为实验组2(T2组),4℃过夜预覆盖,加入PMN悬液前以PBS液洗孔2次;部分孔中加入终浓度为100nmol/L的趋化肽fMLP(N-Formyl-Met-Leu-Phe)作为实验组1(T1组)。然后各孔以1×106/1mL分别加入牙周健康或重度牙周炎者PMN悬液,仅加入PMN悬液而无Fg或fMLP者作为空白对照组(C组),各实验孔均设2平行孔。24孔板于50mL/LCO2、37℃条件下孵育,并分别于第2、8小时取各孔上清液,2500r/min离心5min后分装、-20℃冻存;采用定量夹心ELISA法,按试剂盒说明分别检测细胞培养上清液中的IL-1β、IL-8水平。1.3统计学处理采用SPSS11.0统计软件配对t检验、方差分析(ANOVA)和最小显著差(LSD)法多重比较进行统计学处理,检验水准为双侧α=0.05。2结果2.1不同牙齿周期的pmn分泌il-1进行比较(表1)2.2不同牙齿周围的pmn分泌il-8以进行比较(表2)3重度慢性牙周炎病人pmn的双重感染反应特点机体过度炎症和免疫反应是牙周组织破坏的主要原因。虽然单个的活化单核细胞可释放较PMN更多量的促炎细胞因子,但PMN在炎症牙周组织和龈沟液中数量巨大,因此它们是牙周病损区细胞因子的主要来源,在牙周炎发生、发展中具有重要作用。VanDyke等认为,重度慢性牙周炎病人PMN可能并非“功能低下”,而是“炎症反应过度”,它们对刺激可产生异常强烈的炎症反应,分泌的促炎细胞因子水平显著高于正常PMN,并将其这一特点称为“过度炎症反应特征”。趋化性甲酰三肽fMLP可在结构上模拟感染部位的微生物趋化肽激活PMN,因此,本文将其作为实验组刺激物观察其对PMN分泌功能的影响,同时也作为Fg组的阳性对照以观察二者对PMN作用的异同。结果发现:受Fg或fMLP刺激后,重度慢性牙周炎病人PMN分泌IL-1β、IL-8的水平均较牙周健康者高(虽然某些水平差异未达统计学意义),提示重度慢性牙周炎病人外周血PMN存在“过度炎症反应特征”,对一些刺激反应强烈,可分泌高水平的促炎细胞因子。顽固性、侵袭性牙周炎、I型糖尿病病人也具有这种“过度炎症反应”表型的吞噬细胞,但这种特殊表型是长期炎症刺激诱导形成抑或细胞本身固有的遗传特征,目前尚无定论。Beck、Offenbacher等曾据此推测,具有这种特殊吞噬细胞表型的个体可能是牙周炎、CHD易感者,这些个体一旦牙周炎病损确立,即会导致细菌内毒素和高水平促炎细胞因子对全身血管系统的慢性反复刺激。促炎细胞因子IL-1β不仅与牙周组织破坏密切相关,还可刺激内皮细胞表达血管细胞黏附分子-1而促进单核细胞与血管内皮的黏附、上调低密度脂蛋白受体的基因转录而促进脂质成分在巨噬细胞中集聚并形成泡沫细胞、使平滑肌细胞增生和迁移,促进CHD病理基础——动脉粥样硬化的形成。趋化因子IL-8可趋化募集PMN、加重牙周炎症反应,并且具有与单核细胞趋化蛋白-1相似的作用,可趋化T细胞进入粥样硬化病损区,促进平滑肌细胞增殖和迁移。然而,不论是否具有“过度炎症反应”表型,PMN表面β2整合素受体与配体的结合可激活PMN。急性期蛋白成分Fg是β2整合素受体的天然高亲和力配体,二者结合可介导PMN黏附并启动其炎症相关信号转导和基因表达,诱导PMN呼吸爆发和脱颗粒反应,分泌促炎细胞因子、加重炎症反应。本研究结果也显示:与Fg作用后,PMN分泌IL-1β、IL-8的水平显著高于对照组(P<0.05),也显著高于PMN的强刺激因子趋化肽fMLP刺激组(P<0.05)。可以推测,由于重度牙周炎病人PMN可能具有“过度炎症反应特征”、可分泌高水平促炎细胞因子,同时,严重的牙周感染、炎症可引发急性期反应、导致Fg水平升