不同剂量致敏原对过敏性哮喘模型血清特异性抗体的影响

不同剂量致敏原对过敏性哮喘模型血清特异性抗体的影响

过敏哮喘由免疫球蛋白e（ige）诊断，由肥大细胞、嗜酸性粒细胞和t淋巴结引起的过敏性疾病。研究表明,过敏性哮喘发作时,患者IgE水平显著升高。有学者报道,不同剂量的过敏原会引发机体辅助性T细胞(Th)向Th1和Th2分化的不同趋势,从而影响其临床结局。本研究观察不同剂量的致敏原对过敏性哮喘模型小鼠血清特异性抗体IgE、IgG2a和白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-12(IL-12)、γ-干扰素(IFN-γ)等炎性细胞因子的影响,现报告如下。1材料和方法1.1实验动物中心雌性BALB小鼠45只,8周龄,体质量20~25g,平均(22.36±1.08)g,均购自山东省实验动物中心。45只小鼠随机分为4组:空白对照组10只,低剂量组12只,中剂量组11只,高剂量组12只。1.2血清及缓冲液试剂超声雾化器购自上海四菱医疗器械厂,鸡卵蛋白(OVA)购自美国Sigma公司,胎牛血清(FBS)及PBS缓冲液均购自武汉博士德生物工程有限公司,ELISA试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。1.3不同剂量ova的单次注射分别将10、100、1000μg的OVA溶于含40mg氢氧化铝、pH值7.4的200μLPBS缓冲液中,各组于第0、7、14天分别进行腹腔注射:空白对照组注射不含OVA的PBS缓冲液200μL,其余3组分别注射上述含不同剂量OVA的PBS缓冲液200μL。第15~20天内将小鼠置于雾化吸入箱内进行雾化激发致敏,通过超声雾化发生器雾化吸入5%的OVA生理盐水溶液,20min/(次·d),共处理6d。小鼠出现呼吸急促、口唇紫疳、烦躁不安、行动迟缓、腹肌痉挛及大小便失禁等症状即为造模成功。1.4检测方法1.4.1特异性抗体检测最后一次雾化激发致敏24h后,取各组小鼠眼内眦静脉血,离心后取血清,以ELISA试剂盒检测特异性抗体IgE、IgG2a含量。1.4.2各组小鼠细胞的生长取血后处死小鼠,取出脾脏,在金属网上磨碎,离心后取细胞沉淀,悬于加有10%FBS的RPMI培养液(100aU/mL青霉素+100μg/mL链霉素)中制备单细胞悬液。将细胞悬液置于细胞培养板内,每只小鼠细胞培养2孔,1孔加入200mg/L的OVA,1孔设为空白对照。细胞培养板置于含5%二氧化碳的潮湿环境中37℃培养24h后,收集上清液置于-80℃冰箱保存待测,以ELISA法检测血清IL-4、IL-5、IL-12及IFN-γ的含量。1.4.3肺组织病理学样本的制作小鼠处死后取右肺门至边缘处3mm厚度的组织标本,以15%甲醛固定,石蜡包埋切片后,进行苏木精-伊红(HE)染色。1.5观察指标观察各组小鼠肺组织病理变化、血清特异性抗体IgE、IgG2a水平及血清IL-4、IL-5、IL-12及IFN-γ水平差异。2结果2.1低剂量组的病理组织学观察空白对照组肺组织无明显炎细胞浸润,各给药组均出现不同程度炎细胞浸润,低剂量组最为显著,镜下可见上皮细胞断裂或脱落,杯状细胞增生,血管壁水肿,支气管壁增厚,周围见大量以嗜酸性粒细胞和淋巴细胞为主的炎细胞浸润。中、高剂量组炎症反应依次减轻。见图1。2.2两组患者不同时点证试验及显著比较见表1低、中、高剂量组IgE水平呈递减趋势,组间差异显著(P<0.01),且均显著高于对照组(P<0.01);各实验组血清IgG2a水平呈递增趋势,组间差异显著(P<0.01),且均显著低于对照组(P<0.05或P<0.01)。见表1。2.3两组患者,总总p对比,2组低、中、高剂量组血清IL-4、IL-5水平呈递减趋势,组间差异显著(P<0.01),且均显著高于对照组(P<0.01);各实验组血清IL-12及IFN-γ水平呈递增趋势,组间差异显著(P<0.01),且均显著高于对照组(P<0.05或P<0.01)。见表2。3模型小鼠血清中th2细胞、th1和ige含量的变化最早、最经典的过敏性哮喘动物模型是通过豚鼠制备,但由于相应检测试剂较为缺乏,限制了其广泛应用,而小鼠试剂来源广泛,实验费用相对低廉,近年来逐步地应用于建立哮喘模型。过敏性哮喘是一种以多种炎症细胞和/或细胞因子浸润、IgE升高、肺部组织结构重塑以及气道反应性增高为特征的慢性气道炎症,属于IgE介导的Ⅰ型超敏反应。当致敏原进入机体,CD4+Th2细胞和B细胞被激活,产生特异性IgE,后者与肥大细胞、嗜酸性粒细胞结合,使机体处于致敏状态;当相同的致敏原再次激发时,肥大细胞等炎性细胞就会释放大量炎性介质,诱发机体生理功能紊乱,疾病发作。目前认为,Th1/Th2细胞平衡紊乱,Th1细胞朝向Th2细胞分化,IgE含量增加是过敏性哮喘发作的关键环节。Th2细胞分泌IL-4、IL-5等多种细胞因子,而IL-4可诱导B细胞的Ig类别转化,导致IgE增加,IgE既能启动速发相过敏反应,也可诱发迟发相过敏反应,对过敏性哮喘的发生发展起促进作用;IL-5则具有趋化嗜酸性粒细胞聚集的作用,而嗜酸性粒细胞是参与炎症浸润的主要效应细胞,可加速气道组织结构的破坏,这些炎症细胞和促炎性细胞因子共同引发或促进呼吸道炎症的发生和发展。Th2细胞则可分泌IL-12、IFN-γ等细胞因子,抑制Th2型细胞因子的促炎作用,抑制致敏原引发的过敏作用。成功的免疫治疗可有效降低IgE水平,诱导B细胞在合成免疫球蛋白时由IgE向IgG转化,而IgG作为抗体可捕获抗原,与之形成抗原-抗体复合物,从而缓解过敏症状。当小鼠在致敏原作用下出现Th2细胞占优势,IgE含量增加,而Th1型细胞因子含量降低的趋势时,就会表现出过敏性哮喘表型,即造模成功。尽管个体暴露于致敏原下是过敏性哮喘发作的始动环节,但研究发现对过敏性患者重复给予大浓度致敏原的免疫治疗可能诱导其产生免疫耐受,患者体内Th2型细胞因子表达水平下降,从而实现哮喘逆转。因此,掌握恰当的致敏原浓度以确保小鼠模型能真实表现出过敏性哮喘的临床特征,又不致产生免疫耐受是建立哮喘模型的关键问题。商艳等采用不同剂量的OVA致敏激发小鼠,制备过敏性哮喘模型,结果表明,低剂量组(10μgOVA)小鼠肺部炎症表现最明显,支气管肺泡灌洗液中白细胞、嗜酸性粒细胞含量及血清IgE水平显著高于对照组及其他各剂量组。湛孝东等采用7种不同浓度的致敏原制备小鼠模型,结果表明,低浓度OVA连续致敏的小鼠肺部病理改变最为显著,高浓度OVA造模的效果较差。本研究结果表明,低剂量组小鼠的肺组织炎细胞浸润最明显,且血清IgE、IL-4、IL-5水平显著高于对