草鱼肝微粒体cyp酶含量及其活性研究

草鱼肝微粒体cyp酶含量及其活性研究

随着药物使用安全从“动物安全”向“食品安全”的转变，以及药物残留问题引起了国内外消费者的关注。药品残留是评价水产品质量的重要指标之一。如何对水产动物进行合理用药,促进药物的转化吸收、减少药物残留成为一个需要迫切解决的问题。绝大多数药物在生物体内的生物转化是通过细胞色素P450(cytochromeP450,CYP)介导。因此,研究鱼类药物代谢酶,对了解药物在水产动物体内的作用机理与消除规律,进而对指导临床合理用药及药物残留监控有着重大意义。目前对于食用鱼类药物代谢酶的研究尚不多见,对食用鱼类体内的CYP酶的情况还不清楚。笔者以我国主要养殖鱼类草鱼(Ctenopharyngodonidellus)为对象,提取其肝微粒体,研究了其肝微粒体P450酶系的含量,确定了草鱼肝微粒体中CYP酶系种类及活性水平,为进一步探讨水产动物的合理用药奠定基础。1材料和方法1.1试剂和仪器α-苯甲磺酰氟(PMSF)(99%)、NADPH(98%,产地Roche)、1,4-二硫苏糖醇(DTT)、牛血清白蛋白(99%)、1-苯基-2-硫脲(PTU)购于华美生物工程公司,7-羟基-3-异吩噁唑酮(Resorufin,RF)、香豆素(Dicumarol)、7-乙氧基-3-异吩噁唑酮(Ethoxyresorufin,ERF)均为Sigma产品。其它试剂均为国产分析纯。紫外分光光度计(THERMOSPECTRONICHELIOS-γ),超速离心机(日立CP70MX),荧光分光光度计(SHIMADZURF-10A)。KHB缓冲液:0.066MNa2HPO455.4ml,0.066MKH2PO444.6ml。匀浆缓冲液:10%甘油,1mMPTU,1mMPMSF,1mMEDTA,0.1mMDTT,以0.1MKHB(pH7.5)配制,保存于4℃。保存缓冲液:20%甘油,1mMPMSF,1mMEDTA,0.1mMDTT,以0.1MKHB(pH7.5)配制,保存于4℃。1.2肝脏组织匀浆的制备草鱼购于江苏南通农场,体重200±23g。暂养5d后,剪断鳃弓,放出血液,立即打开腹腔,取出肝脏组织,用滤纸擦净表面血污,称肝重,平均肝重1.28±0.11g。将肝脏剪碎,用KHB缓冲液漂洗2次,充分去除肝脏血液。按每克肝脏组织加3ml缓冲液的比例加入匀浆缓冲液,用内切式组织匀浆机在冰浴中制成匀浆,将匀浆10000r/min,4℃离心20min,取上清液转移至超速离心管内,33000r/min(水平转子),4℃离心60min。弃上清,淡红色沉淀物即为肝微粒体。将肝微粒体沉淀取出后用保存缓冲液悬浮,经超声细胞粉碎仪轻微混匀后,分装于冻存管中,置-70℃保存。1.3肝微粒体蛋白含量的测定1.3.1sa母液中蛋白提取在试管中分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4mlBSA母液(500μg/ml),补充0.1MNaOH至1ml,按照Lowry法测蛋白。以系列浓度的牛血清白蛋白为横坐标,OD值为纵坐标,进行线性回归,求得牛血清白蛋白线性回归方程。1.3.2微粒体样品中的蛋白浓度测定将待测草鱼肝微粒体样本稀释20倍,取稀释后样本0.1ml,其余同标准曲线操作步骤。依据线性回归方程计算待测样本中蛋白含量。1.4cyp酶和细胞色素5-1含量测定CYP含量测定采用CO还原差示光谱法。以KHB缓冲液将待测微粒体悬液稀释至1mg/ml蛋白含量,加入数毫克连二亚硫酸钠,立即混匀。等量分装到两个比色杯中,分别作为对照和样本,于样本池中充一氧化碳30s,紫外分光光度计在400~500nm波段扫描。以450nm和490nm的吸光差除以消光系数91算出CYP酶含量(nmol/mg)。细胞色素b5含量测定:除不进行CO充气外,其余步骤与细胞色素P450含量测定方法相同。以423nm和490nm的吸光差除以消光系数171,算出细胞色素b5含量(nmol/mg)。1.5-乙氧异吩唑酮-o-脱乙基、氨基比林-n-脱甲基反应CYP酶各亚型活性的测定基于以下探针反应:苯胺-4-羟化反应(苯胺-4-羟化酶,4-anilinehydroxylation,CYP2E),7-乙氧异吩噁唑酮-O-脱乙基反应(7-乙氧异吩噁唑酮-O-脱乙基酶,7-ethoxyresorufin-O-deethylation,CYP1A),氨基比林-N-脱甲基反应(氨基比林-N-脱甲基酶,aminopyrine-N-demethylaion,CYP3A)。反应体系中NADPH浓度为1mM,微粒体蛋白浓度为1mg/ml。1.5.1微粒体、苯胺、nadph的合成配制10μmol/L4-氨基酚工作液,取此工作液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0ml,用6%TCA补充至1ml,加至已盛有1%苯酚的试管中,混匀,加入1ml1%Na2CO3,室温放置30min,630nm比色,绘制4-氨基酚标准曲线。将含有微粒体、苯胺、NADPH的反应液在37℃水浴,60min后加1ml冰冷的20%TCA,冰上放置5min终止反应。反应体系于4500r/min离心10min,取1ml上清液加入到已盛有1ml1%酚的试管中,混匀,加入1ml1%Na2CO3,室温放置30min,630nm比色。酶活(nmol/mg/min)以每毫克蛋白单位时间内的4-氨基酚生成量表示。1.5.2发和发射波长以荧光分光光度计测定上清液中RF的相对荧光强度,激发和发射波长分别为560nm和590nm。根据标准曲线计算RF浓度,计算EROD活性(nmol/mg/min),以单位蛋白在单位时间内的RF生成量表示。1.5.3甲醛标准曲线的制备以0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mM甲醛为浓度梯度制备甲醛标准曲线。氨基比林-N-脱甲基酶活性测定依据Hantzsch原理,采用Nash比色法进行。酶活单位(nmol/mg/min)以每毫克蛋白单位时间内的甲醛生成量表示。2结果2.1ph450在充co过程中的扫描结果细胞色素P450是一种血红蛋白,当铁蛋白的铁离子被还原,与CO结合形成复合物,在450nm处有最高吸收峰,它的还原形式在体外极不稳定,易被蛋白酶酶解,充CO气体的速度太快也会使泡沫太多导致蛋白变性。失活的P450在充CO后扫描420nm处吸收峰比较明显。细胞色素b5的还原形式在波长423nm处有最大吸收峰(见图1)。2.2b计算2牛血清白蛋白标准曲线:以系列浓度牛白蛋白为横坐标,OD680值为纵坐标绘制的标准曲线。此标准曲线的线性回归方程为Y=0.0023X+0.0022,R2=0.9992。4-氨基酚标准曲线:以OD值为纵坐标,4-氨基酚系列浓度为横坐标绘制标准曲线,线性方程为Y=0.0101X-0.0001,R2=0.9995。RF标准曲线:以相对荧光强度为纵坐标,RF浓度为横坐标绘制标准曲线,其线性回归方程为Y=6.2368X+0.8659,R2=0.9798。甲醛标准曲线:以OD值为纵坐标,甲醛系列浓度为横坐标绘制标准曲线,线性回归方程为Y=0.0037X+0.005,R2=0.9979。2.3细胞色素p450和b以lowry法测得草鱼肝微粒体蛋白含量,以差示光谱测定细胞色素P450和b5含量(见表1),细胞色素b5含量为CYP酶含量的42.64%。2.4cyp2e、cyp1a和cyp3a活性以苯胺、7-乙氧基-3-异吩噁唑酮、氨基比林为特异性底物,以苯胺-4-羟化酶、7-乙氧异吩噁唑酮-O-脱乙基酶、氨基比林-N-脱甲基酶活性分别指示CYP2E、CYP1A和CYP3A活性(见表2),反应体系中底物浓度分别为8mM、0.005mM、0.005mM。3cyp酶活性测定结果药物在体内的生物转化主要靠肝细胞内滑面内质网上细胞色素P450酶(CYP酶)进行氧化、还原、水解等代谢。许多药物对细胞色素P450酶系活性有抑制或诱导作用,当与其它需经CYP450代谢的药物联合应用时,会影响这类药物的代谢,从而产生药物相互作用。美国FDA已要求新药申报时提供有关对P450影响的资料(包括参与代谢的P450酶和对P450亚型的诱导、抑制作用等)。以超速离心法提取草鱼肝微粒体,微粒体样品充CO后进行扫描测定CYP酶含量,在波长450nm处呈现一特异性吸收峰(图1),这是因为CYP酶是一种血红蛋白,当铁蛋白的铁离子被还原,与CO结合形成复合物,因此该酶又称为细胞色素P450。但是CYP酶在体外不太稳定,容易失活,以KHB缓冲液制备的样品进行扫描测定,在420nm处吸收峰比较明显表明有失活的CYP酶存在,这样的样品不能用于酶活测定。制备和保存过程中在缓冲液中添加PTU、PMSF、EDTA、DTT等蛋白酶抑制剂,有效防止了CYP活性的丧失,保证了测出数值的准确性。P450酶系典型的催化循环机制是其单加氧机制,通过P450酶系的电子传递系统来实现,细胞色素b5和NADH-b5还原酶组成的电子传递支路可作为其中一个电子的来源。因此,细胞色素b5的含量多少直接影响P450酶的活性大小。氧化型的细胞色素b5经还原剂作用后转变成还原型细胞色素b5,在423nm处呈现最大吸收。本试验测得草鱼微粒体细胞色素b5含量约为P450含量的一半。本试验测得CYP含量为0.619±0.102nmol/mg,略