氨甲酰胆碱和毛果芸香碱对血管内皮细胞m受体基因表达调节作用的比较

氨甲酰胆碱和毛果芸香碱对血管内皮细胞m受体基因表达调节作用的比较

血管内皮细胞具有重要的功能作用。乙酰胆碱（ach）可诱导表皮内皮细胞扩张反应，是评估血管内皮细胞功能是否正常的经典指标。Khurana等在M3基因敲除小鼠主动脉上研究发现:ACh诱发的内皮依赖性血管舒张反应大大减弱,因此认为主动脉内皮依赖性血管舒张反应主要是由M3介导的。Yamamada等采用同样的方法研究认为脑微动脉内皮依赖性血管舒张反应主要是由M5介导的。本实验室研究发现M受体亚型非选择性激动剂毛果芸香碱在浓度高达100μmol·L-1时仍不能诱发内皮依赖性血管舒张反应,而其他M受体亚型非选择性激动剂如氨甲酰胆碱等均可诱发内皮依赖性血管舒张反应,这一现象在其他实验室已经得到证实。由此推论氨甲酰胆碱和毛果芸香碱对血管内皮细胞M受体作用不同,氨甲酰胆碱可以激活血管内皮细胞M受体,诱发内皮依赖性血管舒张反应,而毛果芸香碱则不可。本文以氨甲酰胆碱和毛果芸香碱为工具药,观察二者对M受体各亚型基因表达的影响,在基因水平分析二者对内皮依赖性血管舒张反应产生不同效应的原因。1材料和方法1.1其他coearol和osti合酶产品DMEM培养基、小牛血清、,TRlzol、SuperScriptTM为GibcoBRL公司产品;胶原酶、氨甲酰胆碱、毛果芸香碱为Sigma公司产品;Oligo(dT)15、dNTP、RnasinⅠ、DNaseⅠ、TaqDNA聚合酶为Promega公司产品。GDS-8000凝胶成像仪为UVP公司产品。1.2em培养基急性分离牛主动脉,0.1%胶原酶消化内皮细胞,接种于培养瓶内,加入含10%小牛血清的DMEM培养基。取3～5代生长良好无杂细胞污染的内皮细胞,换入含0.5%小牛血清的DMEM培养基培养12h,分别加入DMEM培养基、氨甲酰胆碱(carbachol)、毛果芸香碱(pilocarpine),药物终浓度为10-4mol·L-1,给药后10h提取细胞总RNA。1.3总rna表达按TRIzol试剂盒操作方法提取细胞总RNA,加入DNaseⅠ以防止DNA污染,取少量做总RNA定量,调整浓度为1μg·μl-1,-70℃冻存。1.4go-dtdtpcr扩增按SuperScriptTMⅡ推荐方法进行,终体积20μl,其中总RNA5μl,500μg·μl-1Oligo(dT)151μl,10mnmol·L-1dNTP1μl,5×buffer4μl,0.1mol·L-1DTT2μl,RNasinⅠ1μl,SuperScriptTMⅡ1μl,Nucleasefreewater5μl。PCR扩增仪上运行:65℃5min,42℃50min,70℃15min;4℃保存。1.5-actin-mM受体各亚型和作为内参照的β-actinPCR反应寡核苷酸引物由上海博亚公司合成,引物序列见表1。PCR反应终体积为25μl,其中50pmol·μl-1上下游引物、10mmol·L-1dNTP、5U·μl-1Taq酶各0.5μl,上述方法合成的第一链cDNA2μl,10×buffer2.5μl,ddH2O18.5μl。PCR反应条件:94℃5min;94℃30s,61℃(M1、M3、M4、M5)/56℃(M2、β-actin)30s,72℃60s,35个循环;72℃10min。β-actin和M受体各亚型用同一模板进行扩增。以模板为不经过反转录的总RNA作为阴性对照,扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,UVPGDS-8000凝胶成像仪进行图像分析,P<0.05表示差异有显著性。1.6统计处理采用SAS统计软件进行统计分析。实验数据以均数±标准差()表示,组间比较采用Dunnettu分析。2结果2.1双链生物酶质量比b细胞总RNA的OD260/OD280均大于1.8,说明RNA中蛋白质和DNA残量极少,RNA质量可靠。将RNA反转录合成双链cDNA,1.2%琼脂糖凝胶电泳显示双链cDNA呈现为大小介于0.5kb到5kb之间的弥散条带,说明制备的双链cDNA质量较好。以未经反转录的总RNA进行RT-PCR,未扩增出特异条带,作为阴性对照,以排除样品中DNA污染。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示M受体5个亚型均出现了与预期长度相匹配的特异性条带,部分基因扩增产物进行了测序,符合相应GenBank数据(图1)。用GDS-8000Labworks软件对电泳结果进行图像分析,以各基因条带灰度值与相同模板β-actin条带灰度值的比值作为mRNA表达的相对值,M,～M5的相对表达值分别为0.20±0.11、0.20±0.02、0.12±0.06、0.31±0.02、0.28±0.08(图2)。2.2m受体的亚型氨甲酰胆碱和毛果芸香碱10-4mol·L-1分别作用于牛主动脉血管内皮细胞10h后,M受体5个亚型mRNA表达量均显著增加,与给药前相比有显著性差异(P<0.01,n=6),氨甲酰胆碱和毛果芸香碱之间无差异(图3、4)。3民间海因基因激活氨甲酰胆碱和毛果芸香碱均为M受体非选择性激动剂,能激活不同部位的M受体,但对血管内皮上存在的M受体作用不同,具体表现为氨甲酰胆碱可以激活M受体,诱发内皮依赖性血管舒张反应,而毛果芸香碱则不可。本研究发现氨甲酰胆碱和毛果芸香碱均能上调M受体5种亚型基因表达,即二者均可激活血管内皮细胞上表达的M受体。氨甲酰胆碱和毛果芸香碱虽然均可激活血管内皮细胞上表达的M受体,但激活后信号转导途径可能不同,造成对血管张力影响的不同。Akam等利用免疫共沉淀技术研究发现毛果芸香碱不能激活Gq蛋白