hplc法鉴别和测定维c银翘片中维生素c的含量

hplc法鉴别和测定维c银翘片中维生素c的含量

c银杏叶收集在国家药物管理局的国家药物标准（标准编号：ws3-b-4000-98-2003）中，维生素c作为一个标准使用反应法（鉴定）和碘滴定法（含量测定）进行验证。对某厂生产的维C银翘片经过检验,结果鉴别项和含量测定结果均符合规定,但用拟定的薄层色谱鉴别方法却未能检出维生素C,说明标准中所附的维生素C的鉴别和含量测定方法专属性不强。为了能够准确地对维C银翘片中的维生素C进行质量控制,我们采用HPLC法对维C银翘片中的维生素C进行了定性鉴别和定量测定。1仪器、试剂和样品1.1仪器与检测方法WatersAllianceHT型高效液相色谱仪,Waters2996二极管阵列检测器,Waters2487紫外检测器,岛津2100紫外分光光度计。1.2对照品的制备甲醇(色谱纯,Tedia公司,美国),水(超纯水),其它试剂均为分析纯。维生素C对照品由中国药品生物制品检定所供,供含量测定用,批号:100425-200301。试验用正品维C银翘片为x药厂样品,可疑维C银翘片为y厂生产。2方法2.1流动相及流速色谱柱:C18柱(Phenomenex公司luna柱,250mm×4.6mm,5μm),柱温:35℃,流动相:甲醇—水—冰醋酸(15:85:0.5),流速:1.0ml/min,检测波长:265nm。在此色谱条件下,理论板数按维生素C峰计算均在5000以上,维生素C峰与其它组分峰能达到基线分离。2.2光谱扫描结果取维生素C对照品溶液,在600nm～200nm范围内进行光谱扫描,结果在265nm波长处有最大吸收,且在此波长处样品杂质峰干扰小,维生素C峰与其它组分峰能达到基线分离。故选择265nm作为检测波长。2.3对照溶液的制备取维生素C对照品,加流动相制成每1ml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。2.4供试品溶液制备取本品10片,除去包衣,精密称定,研细,取约1片的量,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加流动相100ml,称定重量,超声处理20min,取出,放冷,称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液。2.5准分离主溶液的制备除维生素C外,其余按本品处方比例称取适量,依照制备工艺制成阴性模拟制剂,照上述供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。2.6c银翘片的色谱检测照上述色谱条件,取上述几种溶液各适量,分别注入液相色谱仪。供试品(正品)色谱在与对照品色谱相应的位置上,有一大小相近的色谱峰,掺假维C银翘片在此保留时间有一微小的色谱峰(经Waters2996二极管阵列检测器检测也为维生素C峰),而阴性液在此保留时间无色谱峰出现。(见图A、B、C、D)。3结果3.1线性回归检测取维生素C对照品,加甲醇制成每1ml含0.50mg溶液,精密吸取1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl进样,测定。以进样量W(μg)为纵坐标、峰面积积分值A为横坐标,进行线性回归。结果维生素C线性回归方程为Y=1.182×10-06X-0.0135(r=0.9997),线性范围为0.50～10.0μg。3.2精密度测试精密吸取同一对照品溶液10μl,重复进样6次,测得维生素C峰面积平均值为4230003(RSD=1.2%)。3.3维生素c峰面积取同一供试品溶液,精密吸取10μl,每隔2h测定一次,计算维生素C峰面积平均值为5023774(RSD=1.4%)。供试品溶液在24h之内稳定。3.4重复试验取同一样品(某药厂生产)6份,分别按2.4项下方法操作测定。结果平均每片含维生素C为51.56mg(RSD=2.0%)。3.5维生素c含量的测定取3.4项下已知含量的供试品6份,各精密加入维生素C对照品一定量,照供试品溶液的制备法进行处理,测定其中维生素C的含量。结果维生素C的平均加样回收率为98.48%(RSD=2.3%)。3.6样品含量的测量取维C银翘片,用本实验方法及原标准所附含量测定方法测定其中维C银翘片的含量(按占标示量49.5mg的百分比计)。结果见表1。4高值铜胁迫法供试品提取溶剂与提取方法的选择:(1)取本品10片,除去包衣,精密称定,研细,取约1片的量,精密称定,精密加乙醇10ml,浸渍过夜,滤过,精密量取续滤液1ml,加水稀释至10ml,摇匀,即得。(2)取本品10片,除去包衣,精密称定,研细,取约1片的量,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加流动相100ml,称定重量,超声处理20min,取出,放冷,称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液。对以上两种方法进行对比试验,结果提取完全性、杂质干扰等情况均无甚差别,为便于操作,选择第二法作为正文方法。针对试验中的可疑维C银翘片,采用薄层色谱法未能检出维生素C,但采用HPLC法却检出微弱小峰(