肿瘤的分子诊断

肿瘤的分子诊断

器官病理学组织病理学细胞病理学免疫病理学分子病理学

应用分子诊断技术，对肿瘤发生发展的病理学机制及生物学行为能从分子水平上加以认识，其范围覆盖分子生物学和细胞生物学。研究较为深入当属癌基因、抑癌基因及其它相关基因。

第一节

肿瘤基因过表达及其检测

一、基因过表达的形式

癌基因一般为单拷贝基因，有其编码的蛋白质，在肿瘤细胞内的一些癌基因在DNA复制过程中形成多个拷贝，形成双微粒染色体和均染区，各种基因的扩增常产生基因产物过表达，表现为RNA和蛋白质量的增加。二、基因过表达的检测

（一）表达产物的检测免疫组织化学（immunohistochemistry）酶联免疫吸附实验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA

）蛋白印迹（Westernblot）流式细胞仪测试法

（二）基因扩增的检测

基因拷贝数的增加和转录产物的mRNA的增加分子诊断检测方法:

原位杂交（insituhybridization,ISH）

荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）

原位PCR（insitupolymerasechainreaction）

Southern杂交（DNA杂交）

Northern杂交（RNA杂交）

原位杂交（insituhybridization,ISH）将分子杂交与组织化学相结合的一项技术，属固相核酸分子杂交范围，它用标记的DNA或RNA为探针在原位检测组织细胞内特异的DNA或RNA序列。优点：1、具有分子杂交的特异性强、灵敏高特点，同时又具有组织细胞化学染色的可见性；2、即可用新鲜组织，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究；3、所需样本量少，可用活组织细针穿刺和细胞涂片；4、应用范围广泛，可对特定的基因（如癌基因、病毒基因）DNA、mRNA的表达进行定位、定性和定量。组织细胞分布和杂交电镜的亚细胞定位研究。分类：DNA-DNA杂交DNA-RNA杂交RNA-RNA杂交直接法间接法同位素标记非同位素标记生物素、地高素、荧光素等双重标记原位杂交技术

荧光原位杂交（FISH）将荧光素标记克隆的DNA片段与染色体或细胞间期染色质杂交，以测试该特定的DNA片段是否有缺失或扩增。比较基因组杂交（comparativegenomehybridizationCGH）即将荧光素分别标记在去除了重复序列的肿瘤及正常细胞基因组DNA上，然后分别与正常染色体进行原位杂交，对该二种不同探针与各个染色体杂交后的信号进行比较，以了解该肿瘤中细胞在不同染色体上缺失或扩增的状态。原位PCR（insitupolymerasechainreaction）将PCR扩增技术和原位杂交技术相结合，通过PCR技术对靶核苷酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使基因拷贝数放大，再通过原位杂交方法检测，以达到对靶核苷酸进行定性、定位、定量分析。一种敏感性高、特异性强，能在组织细胞原位进行低拷贝数基因定性的研究方法。Southern杂交：一种DNA特定序列定位技术。以组织或细胞中获取基因组DNA，用一种或多种限制性内切酶酶切，通过电泳、转印、原位变性固定于一固相支持物，用已标记的特异性DNA或RNA的探针与固定有DNA的固相支持膜杂交，经过放射自显影或化学发光自显影，对显影条带进行分析。Northernblot：用于分析细胞总RNA或含有polyA尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，可了解被测靶基因在细胞内有无过表达。

注意问题：1、提取组织或细胞中的RNA，不需酶切而直接采用电泳。2、操作过程要严格控制RNase的污染。3、RNA只与双链DNA样本中的一条链互补，因此杂交时所需双链DNA探针的量加大；如采用单链探针，无论是DNA抑或RNA探针，或是寡核苷酸探针，均需确定所用探针能与目标RNA互补。第二节

基因突变及其检测癌基因和抑癌基因突变是肿瘤发生中出现频率较高的分子事件，突变的结果则使癌基因激活或抑癌基因失活，导致细胞表型发生变化和肿瘤发生。基因突变是一复杂的过程，不仅在肿瘤细胞中检测到突变基因，对于某些癌前病变或癌前状态的组织细胞中也存在不同形式和不同程度的基因突变，在同一肿瘤的不同发展阶段，可能会涉及多种基因不同形式的突变，说明肿瘤的发生发展是一个多基因参与、多步骤的复杂的生物学过程。一、基因突变的形式点突变（pointmutation）基因缺失(genelosses)

基因异位或重排

（genetranslocationandrearrangment）（一）点突变（pointmutation）指基因在特异位置发生一个核苷酸的改变，使相应蛋白质的一个氨基酸改变，继而改变了蛋白质的空间构型和生物学功能。

错义突变（missence）

无义突变（nonsence）

终止码突变（stopcodon）

移码突变（frameshift）等（二）基因缺失(genelosses)

基因片段缺失是另一种主要的突变形式，缺失的范围差别较大，可以是1-2个碱基，也可以是一个片段甚或一个外显子的缺失。基因片段的缺失可使该基因激活，转录异常，使基因正常的生物学功能丧失。基因缺失与肿瘤的临床病理及生物学行为密切相关。基因缺失中较为频发的分子事件是存在于抑癌基因中的等位基因杂合型和纯合型丢失。基因缺失是肿瘤形成的原因还是细胞恶性转化的结果，尚值得深入探讨。（三）基因异位或重排

（genetranslocationandrearrangement）某一基因在肿瘤细胞中从染色体的正常位置转移到其它染色体的某个位置上称为易位或重排。易位与重排易使癌基因被激活，或是抑癌基因失活，从而使细胞恶变。细胞癌基因的编码序列在DNA分子上是不连续的，由内含子分隔，其中有些序列起到促进子和调节基因的作用，如染色体出现易位、重排等改变时，可使细胞癌基因于正常的抑制子分开而被置于活化DNA序列的控制之下，其中具有代表性的例子为Burkitt淋巴瘤。(四)其它类型的基因突变插入甲基化染色体非组蛋白改变等

癌基因或抑癌基因甲基化（methylation）状态改变与肿瘤发生存在密切关系。二、基因突变的检测方法目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立在PCR的基础上，由PCR衍生出的新方法不断出现，自动化程度越来越高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有了很大提高。（一）PCR-SSCP法单链构像多态性

(single-strandconformationalpolymorphism,SSCP)

基本原理：

单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其碱基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上移动速度改变，不同的二级结构而出现不同的迁移象。该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其灵敏度。该法简单快速，被广泛用于未知基因突变的检测。由于该法的简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法。（二）杂合双链分析法

（heterodulexanalgsis,HA）

直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型DNA双链。由于突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应同源双链DNA不同的迁移率。HA对一些不能用SSCP检出的突变有互补作用，二者结合使用，可使突变检出率提高近100%。

（三）突变体富集PCR

（mutant-enrichedPCR）利用癌基因或抑癌基因某个编码子部位存在已知的限制性内切酶位点，用连续二次的巢式PCR来扩增包括存在酶位点编码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。（四）变性梯度凝胶电泳法

（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）双链DNA在变性梯度聚丙烯酰胺凝胶中电泳，凝胶中自上而下所含变性剂浓度线性增长，DNA片段进行到变性剂某一浓度，与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，但解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同时间解链，则因影响电泳速度变化的程度而被分离。在DGGE基础上，又发展了用温度梯度代替化学变性剂的TGGE法（temperaturegradientgel

electrophoresis,TGGE），由于DGGE和TGGE是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，均需专用的电泳装置。（五）化学切割错配法

（Chemicalcleavageofmismatch,CCM）

基本原理：将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或RNA片段混合变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺或哌啶切割，错配的T能被四氧化锇切割，经变性凝胶电泳可确定是否存在突变。该法检出率很高，也是检测片段最长的方法。应用荧光检测系统可增强敏感度。该法中的化学试剂有毒，故又发展了碳化二亚胺检测法（Carbodiimide，CDI），CDI为无毒物质。（六）等位基因特异性寡核苷酸分析法(allele-specificoligonucleotideASO)

设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR扩增的样品DNA杂交。可以选用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照，如出现阳性杂交带，则表示样品中存在与该ASO探针相应的点突变。（七）DNA芯片技术（DNAChip）

基本原理：

将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在一块固体材料如玻璃片、硅片（集成电路板）上，彼此之间重叠一个碱基，并覆盖所需测定的基因，将荧光标记的正常DNA和突变DNA分别与两块DNA芯片杂交，由于至少存在一个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚焦显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变。可用于基因定位、DNA测序、物理图谱和遗传图谱的构建等，在基因突变检测方面DNA芯片也有广阔的前景。（八）RNA酶A切割法制备RNA探针，与待测DNA或RNA片段杂交，在一定条件下，异源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA的错配碱基可被RNaseA切割，切割产物可通过变性凝胶电泳分离。该法可用于1-2kb的大片段进行检测，并能确定突变位点。（九）染色体分析（analysisofchromosome）

1、荧光原位杂交技术（FISH）2、寡核苷酸引物原位DNA合成技术（OligonncleotideprimedinsituDNAsynthesis,PRINS）

重复引物原位标记技术（repeatedPRINS）

多色原位引物标记（multicolorPRINS）

3、比较基因组杂交

（comparativegenomichybridization,CGH）

基本原理：用不同的非同位素标记物，分别标记被检测的基因组DNA（常为肿瘤DNA）和正常人基因组DNA，两者以1：1混合后制备探针，共同与正常人中期染色体标本进行染色体原位抑制杂交，杂交后对不同荧光物分别进行检测，以每条染色体长轴各位点的被测DNA与正常基因组DNA荧光强度比，反映两组DNA不同序列的拷贝数。只能检测肿瘤基因组中相对于正常基因组平均拷贝数的变化，而不能检测易位、倒位及其它拷贝数没有变化的染色体畸变，基因重排和点突变，也不能检出小于2Mb的缺失。

（十）DNA序列分析（DNAsequencing）应用各种突变检测技术检测到的基因突变，最后都需要用DNA序列分析才能确定突变的类型及突变的位置。

直接测序法（directsequencing，DS）

PCR循环测序法

双脱氧终止法基本原理

第三节

限制性酶切片段长度多态性分析

一、等位基因不平衡应用同一肿瘤的正常体细胞（常分为血细胞或肿瘤旁正常组织）和肿瘤细胞的DNA，检测DNA多态性座位上等位基因不平衡性。当两个等位基因的相关性密度在正常与肿瘤细胞之间出现显著性差异时，就提示肿瘤细胞中多态序列座位处出现突变。限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）当DNA序列的差异发生在限制性内切酶识别位点，或当DNA片段的插入、缺失或重复，可使基因组DNA经限制性内切酶水解后发生片段长度改变。因为这些特异基因片段是限制性内切酶产生的，在不同个体间可出现不同长度的限制性片段类型，故称为限制性片段长度多态性RFLP的研究可以观察到同一患者的正常细胞DNA中存在二个等位基因，而肿瘤