基因操作习题和答案

第一章一.名词解释：1.Genemanipulation基因操作。将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒，质粒或其他载体系统中，再整合到特定的宿主中，从而形成一种新的可持续繁殖的有机体。2.Interruptedgenes间断基因。序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA间隔区，使一种基因分隔成不持续的若干区段。我们称这种编码序列不持续的基由于间断基因。3.Promotor启动子。DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。4.Subcloning亚克隆。当时始克隆中的外源DNA片段较长，具有许多目的基因以外的DNA片段时，在诸如体现、序列分析和突变等操作中不便进行，将目的基因所对应的一小段DNA找出来，这个过程叫“亚克隆”。二.填空题1.基因操作（Genemanipulation）的关键部分是基因克隆（genecloning），genecloning的基本要点有（），（）和（）。参照答案：克隆基因的类型；受体的选择；载体的选择2.（）是遗传物质的基本单位,也是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段。它可以是持续的，也可以是（）；可以是（），也可以是RNA；可以存在于染色体上，也可以（）。参照答案：基因；不持续的；DNA；存在于染色体之外（如质粒，噬菌体等）3.基因操作并不是一种法律概念，除了包括基因克隆外，还包括基因的（）、（）、（）和（）等与基因研究有关的内容。参照答案：体现；调控；检测；改造4.启动子（Promotor）是指（）。一般一种Gene与否体现，（）是关键的一步，是起决定作用的。在转录过程中，Promoter还是（）的结合位点。参照答案：基因转录过程中控制起始的部位；转录起始；RNA聚合酶5.原核生物的RNApolymerase重要由两部分构成：（）和（），其中σ-因子并不参与RNA的合成，它的作用重要是（）。关键酶；σ因子；识别要转录的起始位点6.从（）到（）的这一段距离称为一种转录单位，或者一种转录产物，其中可包括一种或者多种Gene。启动区；终止区7.转录终止子重要有两种，一种是（），另一种是（）。依赖ρ因子；不依赖ρ因子8.Gene的书写方式，一般是写出的DNA序列总是与（）相似的那条链，方向是从（）到（）。对于碱基的位置，一般自转录起始点向两个方向编号，其中转录起始点定为（），（）定为-1。参照答案：mRNA；5'；3'；+1；在起始点上游第一种碱基9.重叠基因（Overlappinggene）是指（），间隔基因（Interruptedgene）是指（）参照答案：一种基因的序列中，单个DNA序列可编码一种以上的蛋白质；在编码序列中间插入的一段无编码作用的碱基序列三.简答题1.简述基因克隆的两个基本特性？参照答案：基因克隆的两个基本特性是一是强调外源核酸分子（一般状况下都是DNA）在不一样宿主中的繁殖，打破自然种的界线未来自于不有关物种的基因放入一种宿主中是基因操作的一种重要特性，基因操作的另一种重要特性是繁殖。2.谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的发展状况？※3.怎样理解gene及其产物的共线性和非共线性？参照答案：基因决定蛋白质的序列构成，是由密码子对应特定氨基酸所决定的。当一种基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列是一一对应时，则表明它们是共线性的。在原核生物中，基因及其产物是共线性的。70年代以来，在真核生物中，发现了间断基因，后来发现这种间断基因在真核生物中普遍存在，也就是后来所说的基因间存在着内含子。内含子指真核生物基因中不能被翻译成蛋白质的DNA片断，但可被转录，当两侧序列的转录RNA被剪接在一起时，就将内含子转录的RNA从整个转录物中除去。外显子是指可以翻译成蛋白质的任一间断的基因片段，一种基因可有多种外显子。内含子并不是一成不变的，具有相对性，对一种DNA片断来说，在某个基因中是内含子，但在另一种基因中却可以作为外显子。4.什么是genecloning？什么是亚克隆（subcloning）？参照答案：基因克隆：一定程度上等同于基因的分离，即从复杂的生物体基因组中，通过酶切，消化等环节，分离带有目的基因的DNA片段。基因亚克隆：初步克隆中的外源片段往往较长，具有许多目的基因片段以外的DNA片段，在诸如体现、序列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一小段DNA找出来，这个过程叫“亚克隆”。5.假如从一种原核生物中cloning某基因（1-2kb），请谈谈它的基本环节？参照答案：①对原核生物染色体DNA进行不完全酶切，纯化所得到的DNA片断，并与载体连接，转化大肠杆菌；②得到转化子后，根据目的基因两侧的已知序列设计探针，杂交，筛选转化子；③所得到的转化子中具有目的基因，深入作亚克隆，一步步地向目的基因迫近，最终可得到目的基因6.什么叫基因工程（GeneEngineering），试从理论和技术两个方面谈谈GeneEngineering诞生的基础？参照答案：基因工程（GeneEngineering）又称基因操作（GeneManipulation）、重组DNA。基因工程是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代措施为手段，将不一样来源的基因（DNA分子），按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以变化生物原先的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的构造和功能。思索题问题：简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。思索题问题：为何说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？思索题问题：简述基因的构造构成对基因操作的影响。第二章一.名词解释1.Restrictionandmodification限制和修饰。宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。外源遗传物质通过甲基化等作用防止宿主的限制作用称为修饰。2.Matchedends匹配末端。识别位点为回文对称构造的序列，经限制酶切割后，产生的相似的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesiveend）。3.Bluntends平末端。在回文对称轴上同步切割DNA的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。4.Isoschizomer：同裂酶。识别相似序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点也许不一样。5.Isocaudiners：同尾酶。来源不一样、识别序列不一样，但产生相似粘性末端的酶。6.Sitepreferences：位点偏爱。某些限制酶对同一介质中的不一样位置的同一种识别序列体现出不一样的切割效率的现象称为位点偏爱。7.Staractivity星星活性。在极端非原则条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个变化的特殊性称星星活性。8.Nickingenzyme切口酶。有些限制酶只切割双链DNA中的一条链，产生单链缺口，这种酶称为切口酶。9.KlenowfragmentKlenow片段。KlenowDNA聚合酶是E.coliDNApolymerase经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5'--3'外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5'外切活性不受影响。10.Sequenase测序酶。是改造的T7噬菌体DNA聚合酶，切除了99%以上的3'--5'外切活性。SequenaseVersion2切除了所有的3'--5'外切活性，用于双脱氧链终止法对长片段进行测序。11.Reversetranscriptase反转录酶。即依赖于RNA的DNA聚合酶，它有5'--3'合成DNA活性，不过无3'--5'外切活性。它来自AMV（禽成髓细胞瘤病毒）或Mo-MLV（Moloney鼠白血病病毒，又称M-MuLV）。12.Terminaltransferase末端转移酶。来源于小牛胸腺，是存在于前淋巴细胞及分化初期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA聚合酶，在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3'羟基端。若dNTP为T或C，此二价阳离子首选钴离子；若dNTP为A或G，此二价阳离子首选镁离子。13.Ligase连接酶。催化DNA5'磷酸基与3'羟基之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来的酶。14.T4polynucleotidekinaseT4多核苷酸激酶。催化ATP的γ-磷酸基转移至DNA或RNA的5'末端。15.Alkalinephosphatase碱性磷酸酶。重要来源于牛小肠（Calfintestinalalkalinephosphatase），简称CIP或CIAP，也有来自细菌（BAP）。催化除去DNA或RNA5'磷酸。16.S1nucleaseSl核酸酶。来源于米曲霉（Aspergillusoryzae），可降解单链DNA或RNA，产生带5'磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链；对dsDNA，dsRNA，DNA:RNA杂交体不敏感。17.ExonuleaseЩ外切核酸酶Щ。来源于大肠杆菌，催化从dsDNA3'-OH逐一清除单核苷酸的反应，底物为dsDNA或线状和带切口或缺口的环状DNA，反应成果是在dsDNA上产生长的单链区。18.Singlestrandbindingprotein单链结合蛋白。此蛋白能协同地与ssDNA结合而不与dsDNA结合，可以减弱链内二级构造的稳定性，从而加速互补多核苷酸的重新退火，并通过消除阻碍DNA聚合酶前进的链内二级构造，而提高这些聚合酶的持续作用能力。19.ProteinaseK蛋白酶K是具有高活性的丝氨酸蛋白酶，属枯草杆菌蛋白酶，可以水解范围广泛的肽键，尤其适合水解羧基末端至芳香族氨基酸和中性氨基酸之间的肽键。K指该蛋白酶通过水解角蛋白（keratin）可认为该霉菌提供所有所需的碳源和氮源。20.Lysozymes溶菌酶。一类水解细菌细胞壁中肽聚糖的酶，常用的是卵清溶菌酶，用于破碎细胞。二.填空题1.Ecok的一般分子构成为R2M2S，在这些亚基中，R亚基具有（）的作用，M亚基具有（）的作用，S亚基具有（）的作用，当该该酶发生作用时，需用到的辅因子有：（）、（）、（）。限制酶；甲基化；识别DNA序列；ATP；SAM；Mg2+2.限制性内切核酸酶（Restrictionendonuclease）的命名是按属名和种名相结合的原则的，一般第一种大写字母取自（），第二、三个字母取自（），第四个字母则用（）表达。参照答案：属名的第一种字母；种名的前两个字母；菌株名3.Ⅱ型限制酶识别回文对称序列，在回文序列（）或（）切割DNA，产生带3'－OH和5'－P基团的DNA的产物，需（）的存在才能发挥活性，对应的修饰酶只需SAM。参照答案：内部；附近；Mg2＋4.从因特网上可以找到限制酶的数据库（），该网站由NewEnglandBiolabs企业维护（）。REBASE5.识别相似序列的限制酶称（）同裂酶6.Ⅰ-CeuI酶是衣滴虫叶绿体大rRNA基因的内含子编码的产物，识别位点为（）bp，识别的关键部位为（）至（）位置的19bp，反应温度为37℃7.位点偏爱是指：（）限制酶对不一样位置的同一种识别序列体现出不一样的切割效率8.1单位NaeⅠ或NarⅠ的定义：（）参照答案：切割1μg腺病毒2DNA在50ul体系中1小时所需的酶量9.有些限制酶只切割双链DNA中的一条链，产生单链缺口，即（）切口酶10.个体间DNA限制性片段长度的差异叫（）限制性片段长度多态性（RFLP）11.DNA载体经HindⅢ切割后产生粘性末端，能发生载体自连，影响载体与外源DNA的连接效率，常用的防止载体自连的措施有（）、（）。去磷酸化；部分补平12.完全的回文序列应具有两个特点即（）和（）。参照答案：可以在中间划一种对称轴，两侧的序列两两对称互补配对；两条互补链的5'--3'的序列构成相似，即将一条链旋转180°，则两条链重叠13.DcmMethylase（Dcm甲基化酶）的识别序列为（）和（），该酶的作用位点为（）。CCTGG；CCAGG；第二个胞嘧啶C的C5位置填空题问题：大肠杆菌中至少有三种依赖于甲基化的限制系统（）、（）、（）。它们识别的序列各不相似，但只识别通过甲基化的序列，都限制CpG甲基化酶作用的DNA。mcrA；mcrBC；mrr14.分别写出如下限制性内切核酸酶（Restrictionendonuclease）的识别序列EcoRⅠ（）、Sau3AⅠ（）、HindⅢ（）。GAATTC；GATC；AAGCTT15.Weiss单位的定义为（）参照答案：在37℃下20分钟内催化1nmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β16.限制性内切核酸酶（Restrictionendonuclease）一般保留在（）浓度的甘油溶液中。50%17.载体和外源DNA经酶切，在进行下一步操作前，需消除限制性内切核酸酶（Restrictionendonuclease）的影响。常用的措施有（）、（）、（）、（）。参照答案：EDTA法；加热法；苯酚抽提法；试剂盒除酶法18.对DNA进行双酶切时，酶切缓冲液的选择原则有(1)（）、(2)（）、(3)（）参照答案：可选用都合适的缓冲液或通用缓冲液；若缓冲液不可替代则先用低浓度的，再加适量NaCl和第二种酶；先用低盐缓冲液再用高盐缓冲液19.DnaseⅠ为内切核酸酶，在不一样的辅因子条件下，产生不一样的酶切效果，当Mg2+存在时（）；当Mn2+存在时（）。参照答案：独立作用于每条DNA链，且切割位点随机；可在两条链的大体同一位置切割dsDNA，产生平端或1到2个核甘酸突出的DNA片断20.KlenowDNA聚合酶是E.coliDNApolymerase经蛋白酶裂解而从全酶中除去（）活性的多肽大片断，而其他活性保持不变。5'--3'的外切活性T4phageDNApolymerase分子量为（）kDa，该酶的3'--5'的外切活性比Klenow酶强（）倍，由于它不从单链DNA模板上替代引物，故可用于（）。114；200；提高诱变反应21.反转录酶来自AMV或Mo－MLV，即依赖于RNA的DNA聚合酶，它有（）活性，但无（）活性。5'--3'合成DNA的；3'--5'的外切22.末端转移酶来源于（），是存在于前淋巴细胞及分化初期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA聚合酶，在（）存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3'羟基端。小牛胸腺；Mg2＋23.T4DNA连接酶的分子量为68kDa，它可以催化DNA5'磷酸基与3'羟基之间形成磷酸二酯键。反应底物为粘端、切口、平端的RNA或DNA。低浓度（）和（）可以提高平端连接效率。聚乙二醇PEG；单价阳离子24.E.coliDNA连接酶与T4DNA连接酶相似，但需（）的参与，且其平端连接效率低常用于置换合成法。烟酰胺－腺嘌呤二核苷酸（NAD＋）T4多核苷酸激酶在高浓度的ATP时发挥最佳活性，（）是其强烈克制剂。NH4＋25.BAL31核酸酶重要活性为3'外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的3'端清除掉单核苷酸；还可从内部切割核酸，作用于单链。BAL31发生作用依赖（），（）可克制其活性。Ca2＋；EGTA26.绿豆核酸酶来源于绿豆芽，与S1酶相似，但比S1酶更温和，在（）上才切割，可使DNA突出端变成平端。大切口27.核糖核酸酶A来源于牛胰，为内切核酸酶，可特异袭击（）。可除去DNA:RNA中未杂交的RNA区，可用来确定DNA或RNA中单碱基突变的位置。RNA上嘧啶残基的3'端28.用于构建嵌套缺失体常用到的核酸酶有（）、（）、（）。DnaseⅠ；外切核酸酶Ⅲ；BAL3129.琼脂糖酶作用于低熔点琼脂糖，它的活性是可切割琼脂糖酶亚单位。由于此酶可分解琼脂糖，因此应用于（）。分离大片段DNA三.选择题1.限制性内切酶一般保留在（）浓度的甘油溶液中。C50%点评：合适浓度的甘油和二甲基亚砜可以作为冰冻保护剂，保护生物大分子的活性。2.限制性图谱与限制性片段长度多态性（RFLP）图谱的最明显区别在于（）参照答案：A前者是物理图谱后者是连锁图点评：详细理解两者的概念3.迄今为止所发现的限制性内切核酸酶可以作用于（）只能作用于双链DNA点评：限制性内切核酸酶的识别和切割序列有很强的特异性，尤其是第Ⅱ型的限制性内切酶。4.已知某一内切酶在一种环状DNA上有4个切点，当用此酶切割该环状DNA，可以得到（4）个片段点评：注意DNA分子的形状，其他条件相似的时候，线状比环状产生的片段要多一种。5.甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生变化，是导致某些酶星星活性的重要原因之一，防止的措施是在酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在（）如下A5%点评：低温下保留生物大分子时，甘油可以作为冰冻保护剂，但反应体系中甘油浓度过高会导致星星活性。6.在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制哪一项最佳（）D酶量点评：多种酶均有适合自己的反应温度；同步根据酶反应动力学，酶切反应一定期间后酶的活性就会减弱或丧失，因此控制酶量是最合适的7.下列试剂中，哪一种可以螯合Ca2＋离子（）DEGTA点评：EDTA螯合Mg2+等金属离子，EGTA螯合Ca2＋离子。8.DNA被某种酶切割后，电泳得到的电泳带有些扩散，下列原因中，哪一项不太也许（）C酶失活点评：理解限制性内切酶酶切本质和DNA电泳试验原理。9.nick与gap的区别在于（）A前者是断开了一种磷酸二酯键，后者是指DNA的单链中有较小的缺失10.可以在切口部位起作用的酶是（）BS1核酸酶点评：BAL31核酸酶重要活性为3'外切核酸酶活性，可以从线性DNA两条链的3'端去掉单核苷酸；S1核酸酶可降解单链DNA或RNA，产生带5'磷酸的单核苷酸或寡核苷酸，中等浓度可在切口或小缺口处切割双链；核糖核酸酶A可以特异袭击RNA上的嘧啶残基的3'端，可除去DNA:RNA中未杂交的RNA区；λ外切核酸酶可以作用于dsDNA，持续逐一释放5’单核苷酸。11.Klenow酶与DNA聚合酶相比，前者丧失了（）活性参照答案：A5'--3'外切酶点评：KlenowDNA聚合酶是E.coliDNApolymerase经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5'--3'外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5'外切活性不受影响。12.限制酶的命名遵照一定的原则，波及来源（宿主），菌株或生物型。命名时（）参照答案：A属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字）点评：限制酶的命名遵照一定的原则，波及来源（宿主），菌株或生物型。命名时，依次取属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字）如下对同裂酶的描述中，哪一项是对的的（）A识别相似序列的限制酶称同裂酶点评：识别相似序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点也许不一样。详细可分为：同裂同切酶、同序异切酶、“同功多位”等13.下列DNA聚合酶中，哪一种酶只切割双链DNA中的一条链，产生单链切口，即切口酶（）ADnaseⅠ点评：在Mg2+存在下，独立作用于每条DNA链，且切割位点随机。在Mn2+存在下，它可在两条链的大体同一位置切割dsDNA，产生平端或1～2个核苷酸突出的DNA片段；KlenowDNA聚合酶是E.coliDNApolymerase经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5'--3'外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5'外切活性不受影响；T4噬菌体DNA聚合酶与KlenowDNA聚合酶相似，但3'--5'外切活性强200倍，且不从单链DNA模板上替代引物；T7噬菌体DNA聚合酶的活性功能与T4噬菌体DNA聚合酶和KlenowDNA聚合酶类似，但3'--5'外切活性为Klenow的1000倍。14.BAP与CIAP的区别在于（）BCIAP68℃时失活，而BAP68点评：CIAP来源于牛小肠碱性磷酸酶，而BAP来自细菌的碱性磷酸酶。BAP抗性强、抗高温和清除污剂。CIAP可用蛋白酶K消化灭活，或在5mMEDTA下。65℃或75℃处理10分钟，然后用酚、氯仿抽提，纯化去磷酸化的DNA，从而除去CIAP的活性。15.下列哪一种酶作用时需要引物（）B反转录酶点评：其他三种酶均只需要DNA链即可16.CIAP催化脱磷酸时有两种最适温度，37℃和56点评：3'端突出时，磷酸基团是内陷的，需要剧烈一点的反应条件。17.有关宿主控制的限制修饰现象的本质，下述描述中只有（）不恰当参照答案：D这一系统的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶点评：根据酶的亚单位构成、识别序列的种类和与否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为四类：Ⅱ型、Ⅱs型、Ⅰ型、Ⅲ型18.限制性内切核酸酶可以特异性地识别（）C双链DNA的特定碱基序列点评：理解限制性内切酶的识别序列。19.如下为同尾酶的是（）BBamHⅠ,Sau3AⅠ,StyⅠ点评：所谓同尾酶即他们可以产生相似的粘性突出末端。其中B选项中BamHⅠ识别位点为G↓GATCC，Sau3AⅠ识别位点为↓GATC，StyⅠ识别位点为CC↓WWGG。（W=AorT）在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA互补链时应选用（）BT7DNA聚合酶点评：T7DNA聚合酶是所有DNA聚合酶中持续合成能力最强的一种20.在大肠杆菌中，大多数均有三个位点特异性的DNA甲基化酶，如下选项中哪一种酶不包括在内（）DSssⅠ点评：SssⅠ甲基化酶来自原核生物Spiroplasma21.在大肠杆菌中，至少有3种依赖于甲基化的限制系统，如下选项中不属于这3种的为（）CmcrD点评：无mcrD22.如下几种核酸酶中，不能用于嵌套缺失的为（）BS1核酸酶点评：S1核酸酶可降解单链DNA或RNA，酶浓度大时可完全消化双链，中等浓度可在切口或小缺口处切割双链。23.下面有关限制酶的论述哪个是错误的（）A限制酶是外切酶而不是内切酶点评：理解限制性内切酶的特性。24.在下列酶中，催化反应不需要ATP的是（）DBamHⅠ点评：Ⅰ型和Ⅲ型限制性内切酶在发生限制作用时需要ATP，Ⅱ型则不需要，而BamHⅠ为Ⅱ型限制性内切酶，在催化反应时不需要ATP25.DNA连接酶在体内的重要作用是在DNA复制、修复中封闭缺口，下列对DNA连接酶的描述中，那项是对的的（）参照答案：A将双链DNA分子中的5'磷酸基团同3'－OH末端重新形成磷酸二酯键点评：理解DNA连接酶的特性。26.下列酶中，除（）外都具有磷酸酶的活性ABamHⅠ点评：磷酸酶活性包括磷酸化活性和去磷酸化活性。四.简答题1.简述限制性内切核酸酶（Restrictionendonuclease）的概念及其生物学功能？参照答案：定义：指识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。生物学功能：保护宿主不受外来DNA分子的感染，可降解外来的DNA分子，从而制止其复制和整合到细胞中。2.PCR引物设计引入酶切位点时，为何需在酶切位点后加上某些碱基？参照答案：限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度规定，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。因此，一般需在设计引物时在限制酶切位点外另加3～4个碱基。3.试回答影响限制性内切核酸酶（Restrictionendonuclease）切割效率的原因？参照答案：外因：反应条件、底物纯度、反应温度和限制性内切酶自身的活性；内因：位点偏爱性；甲基化；底物的构象。4.在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？参照答案：作用是提供一定的蛋白质浓度，起保护限制性内切酶的作用。限制性内切酶在稀释液中会迅速变性，BSA是一种很好的可加入酶反应液中的中性蛋白质。5.何谓Staractivity？简述Staractivity的影响原因及克服措施？参照答案：在极端非原则条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个变化的特性称为星星活性。引起星星活性的的原因：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（>100U/ml）；③低离子强度（<25mM）；④高pH(>8.0)；⑤有机溶剂如PMSD（二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）和sulphalane等；⑥用其他二价阳离子Mn2+、Cu2+、Co2+或Zn2+替代Mg2+。星星活性的克制措施：①减少酶的用量，防止过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到100～150mM（在不克制酶活性的前提下）；④减少反应pH至7.0；⑤使用Mg2+作为二价阳离子。6.某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析也许原因？参照答案：生物体内的DNA序列也许是通过甲基化修饰的，而在体外合成时，缺乏这种修饰作用。当用依赖于甲基化的限制酶DpnI来切割非甲基化的序列时，就会出现不能切割的状况。7.天然的质粒载体（plasmidvectors）一般需经改造后才能应用，包括清除不必要的片段，引入多克隆位点等。试问在此过程中怎样增减酶切位点？参照答案：在酶切水平上，通过酶切和连接产生新的酶切位点。①将产生的5'突出端补平后，再连接以产生新的酶切位点；②同尾末端的连接，不一样的同尾酶切割DNA产生的末端，再互相连接时，可产生新的酶切位点，同步本来的酶切位点却消失；③平末端的连接8.双脱氧终止法测定DNA序列的片段一般不能太长，怎样运用本章所学知识测定较长片段的DNA序列？参照答案：①将所需要测序的DNA片断采用2种不一样的限制性内切酶切割，产生不一样的酶切片段，将此酶切片段连接到载体上，测序后，拼接，即可得到全长的DNA序列；②用一种限制性内切酶进行部分酶切，酶切产物与载体连接后，测序，拼接，即可得到全长DNA片断。采用以上任一措施均可，需要注意的是，在进行部分酶切时，应当控制好条件，要保证所得到的酶切片断能覆盖所需测序的DNA片断。9.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，具有3'--5’参照答案：①运用E.coliDNA聚合酶的5'--3'外切核酸酶活性，可用切口平移法标识DNA，所有DNA聚合酶中只有此酶有此反应；②用于cDNA克隆中的第二链，即单纯的DNA聚合活性；③对3'突出端的DNA作末端标识（互换或置换反应）。10.用T4phageDNApolymerase可进行末端标识，试简述其原理？参照答案：T4phageDNA聚合酶具有3'--5'外切活性和5'--3'的聚合酶活性，3'--5'的外切活性可以被5'--3'的聚合活性所封闭，首先在反应体系中加入一种dNTP，产生3'凹端，然后加入通过标识的dNTP，运用T4phageDNA聚合酶的聚合活性补平3'凹端，即可得到标识了末端的DNA片断。11.BAP和CIAP有何作用？为何一般采用CIAP而不采用BAP？参照答案：作用：催化除去DNA或RNA5'磷酸。BAP抗性强，抗高温和去污剂。CIAP可用蛋白酶K消化灭活，或在5mMEDTA下，65℃处理或7512.依赖于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌体RNA聚合酶和T4或T7噬菌体RNA聚合酶，此类聚合酶可用于体现外源基因，论述常用的构建方略？参照答案：①将T7RNA聚合酶基因置于E.colilacUV5启动子之下，插入到λ噬菌体中，感染E.coli，建立稳定的溶源菌。E.coliBL21（DE3）菌株即为将lacUV5启动子和T7聚合酶基因置于λ噬菌体DE3区，该λ噬菌体DNA整合于染色体的BL21处。若将T7噬菌体启动子控制的目的基因经质粒载体导入该宿主菌中，在IPTG诱导下，可启动外源基因的体现；②先导入带T7噬菌体启动子控制的目的基因的质粒，再用λ噬菌体（带T7RNA聚合酶基因）感染E.coli，激活目的基因的体现。13.简述T4多核苷酸激酶的活性和用途？参照答案：T4多核苷酸激酶的活性催化ATP的γ－磷酸基转移到DNA或RNA的5'末端。可体现为两种反应，正反应指ATP的γ－磷酸基被转移到去磷酸化的DNA5'端，用于对缺乏5'－磷酸的DNA进行磷酸化。在互换反应中，过量的ATP可使该激酶将磷酸化的5'端磷酸转移给ADP，然后DNA从【γ－32P】ATP中获得放射性标识的γ－磷酸而重新磷酸化，因此可用于DNA的末端标识。用途：该酶重要用于对缺乏5'－磷酸的DNA或合成接头进行磷酸化，同步可对末端进行标识。通过互换反应，用于标识5'末端，以供Maxam－Gilbert法测序、S1核酸酶分析以及其他须使用末端标识DNA的环节。思索题问题：限制性内切酶可划分为哪几种类型，各自有何特点？思索题问题：哪些酶可用于DNA片段的末端标识？思索题问题：DNA聚合酶有哪些类型，各有什么活性？思索题问题：在分子克隆中所用的酶重要作用于哪些底物？第三章一.名词解释1.Vehicle载体。将外源DNA或基因携带入宿主细胞（hostcell）的工具称为载体。具有如下三个必须元件：复制原点、多克隆位点和筛选标识。2.Geneclone基因克隆。克隆作动词时，指从单一祖先产生同一的DNA分子群体或细胞群体的过程；作名词时指从一种共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所构成的特殊的生命群体。运用重组DNA技术分离目的基因，称之为基因克隆。3.Genelibrary基因文库。由大量的具有基因组DNA（即某毕生物的所有DNA次序）的不一样DNA片段的克隆所构成的群体，称之为基因文库。4.Plasmidincompatibility质粒不相容性。运用同一复制系统的两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不波及DNA限制系统时出现的现象。5.α-complementationα-互补。指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的α-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现的互补。这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复α-半乳糖苷酶的活性。6.X-gal/IPTG两者都是乳糖的衍生物，X-gal：乳糖操纵子底物，可以作为生色剂，被α-半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落展现兰色；IPTG：乳糖操纵子诱导物。7.lyticgrowth裂解生长状态。噬菌体侵染宿主细胞后，大量复制并组装成子代噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解的现象称裂解生长状态。8.lysogenicstate溶源状态。噬菌体侵染宿主细胞后，将λ噬菌体基因组DNA通过位点专一性重组整合到宿主的染色体DNA中，并随宿主的繁殖传给子代细胞的现象称溶源状态。9.Multiplicityofinfection感染复数。指单个宿主细胞感染的噬菌体颗粒数，等于试验所用的噬菌体与细胞的数量之比。10.Insertionvectors插入型载体。通过特定的酶切位点容许外源DNA片段插入的载体称为插入型载体。11.Replacementvectors置换型载体。而容许外源DNA片段替代载体的非必须DNA片段的载体，称为置换型载体。12.Cosmid粘粒。带有将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的cos序列的质粒。包括质粒复制起点，可以象质粒同样转化并增殖；包括cos位点，可以象噬菌体颗粒同样包装、侵染。13.ReplicativeformDNA复制型DNA。在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体DNA（正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链DNA，用于DNA的复制，这种双链DNA称为复制型DNA。14.Phagemid噬菌粒。具有ColE1复制起点及单拷贝的丝状体噬菌体重要基因间隔区的质粒载体。此基因间隔区含病毒DNA合成的起始与终止及噬菌体颗粒形态发生所必须的所有顺式作用序列。含phagemid的细菌被噬菌体感染后，基因Ⅱ蛋白作用于间隔区，启动滚环复制产生ssDNA并进行包装。15.M13K07helpphageM13KO7辅助噬菌体。M13单链丝状噬菌体的衍生株，基因Ⅱ带有一种G--T的突变。M13KO7基因组双链DNA可体现产生子代单链DNA所必需的所有蛋白。M13K07中突变的基因Ⅱ产物与自身携带的噬菌体复制起点的作用尚不如它与克隆于噬菌粒pUCll8和pUCll9中的病毒复制起点的作用有效，可以保证在细胞所产生的病毒颗粒中来自噬菌粒的单链DNA可以占据优势。16.Yeastartificialchromosomes酵母人工染色体载体。运用酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为酵母人工染色体载体。由自主复制序列、着丝粒、复制子及选择标识等元件构成。17.Bacterialartificialchromosomes细菌人工染色体。是基于大肠杆菌的F质粒构建的高通量低拷贝质粒载体。包括严谨型控制的复制区oriS、启动DNA复制的由ATP驱动的解旋酶（(RepE)，以及三个保证低拷贝并使质粒精确分派至子代细胞的基因座(parA,parB和parC)等元件）。18.P1artificialchromosomesP1人工染色体载体。结合了P1载体和BAC载体的特性，是P1噬菌体载体的改善载体。重组分子不能通过体外包装来感染宿主细胞，而只能通过电转化来将重组分子导入宿主细胞。19.Shuttlevector穿梭载体。可以在两类不一样的宿主中复制、增殖和选择的载体称为穿梭载体。二.填空题1.载体（Vehicle）的类型有（），（），（），（）等。参照答案：质粒载体；噬菌体载体；粘粒载体；噬菌粒载体2.Genecloning是指（），基因文库（Genelibrary）是指（）。参照答案：运用重组DNA技术分离目的基因；由大量的具有基因DNA（即某毕生物的所有DNA次序）的不一样DNA片段的克隆所构成的群体3.Plasmid的定义是（），Plasmid能进行自我复制，大多数为（）链（）状DNA分子，大小一般为（）kb。染色体外的遗传因子；双；闭环；1～2004.（）即为质粒的拷贝数，按照质粒拷贝数的多少，质粒可以分为（）和（），（）质粒多数是某些具有转移能力的大质粒；（）质粒多数是某些不具有转移能力的小质粒。参照答案：单个细胞中所具有的质粒DNA分子数目；严谨型；松弛型；严谨型；松弛型填空题松弛型质粒和严谨型质粒融合后来，杂合质粒一般优先使用（）的复制子。松弛型5.（）称之为质粒的不相容性。假如两个质粒不能稳定地共存于同一种寄主细胞中，则它们属于（）（填相似或不一样）的不相容群。参照答案：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象；相似6.质粒具有转移性，它是指（），它需要（），（）和（）参照答案：在自然条件下，诸多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内；移动基因mob；转移基因tra；转移起始位点7.根据质粒的转移性可以将质粒分为（）和（），一般大质粒都是（），（）一般都是小质粒，其上没有（）参照答案：接合型质粒；非接合型质粒；接合型质粒；非接合型质粒；编码其DNA转移的基因8.按其用途可将标识基因分为选择标识和筛选标识，选择标识一般用于（），筛选标识一般用于（）鉴别目的DNA（载体）的存在；将特殊表型的重组子挑选出来9.常用的用来鉴定重组质粒的细菌菌落的措施有（），（），（）等。参照答案：α－互补；插入失活；原位杂交10.pBR322质粒是基因工程最重要的人工质粒之一，它的大小约为（）kb，用于其组建的三个亲本质粒是（）,（）,和（）。此质粒具有一种colE1松弛型质粒复制子，两个筛选标识氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，其中colE1松弛型质粒复制子来源于（），氨苄青霉素抗性基因来源于（），四环素抗性基因来源于（）参照答案：4.3；pM131；pSC101；pSF2124；pM131；pSF2124；pSC10111.pUC系列的质粒载体是由（）和（）两种质粒构建而来的，其中氨苄青霉素抗性基因来自于（），多克隆位点MCS来自于（）。pUC系列的质粒载体一般是成对存在的如pUC18和pUC19，其重要区别是（）。参照答案：pBR322；M13mp18/19；pBR322；M13mp18/19；MCS方向不一样12.质粒载体的附加功能要素重要有（），（），（）等。参照答案：α－互补；ssDNAphageorigin，promotor13.λ噬菌体Genome的长度约为（）kb，其DNA分子为（）（填单或双）链。它的DNA分子既可以以（）状存在也可以以环状存在，并且可以自然成环，其原因是在λ噬菌体的线性分子的两端各有一种长度为（）个碱基的天然粘性末端，这种粘性末端可以自然成环，成环后的粘性末端就叫做（）。参照答案：50；双；线；12；cos位点14.λ噬菌体在感染大肠杆菌后来，可以进入Lyticgrowth也可以进入Lysogenicstate。假如其基因组DNA通过专一性重组整合到宿主染色体中，则其进入（）；它也可以选择进入（），大量复制并组装子代噬菌体颗粒。Lysogenicstate；Lyticgrowth15.在λ噬菌体载体中，常用的选择标识有（），cⅠ基因失活，和（）等。参照答案：LacZ；spi筛选16.改造后的λ噬菌体才可用作载体，按照改造方式的不一样可将其分为两种类型，即插入型载体（insertionvectors）和替代型载体（replacementvectors）。其中Insertionvectors是指（）；Replacementvectors是指（）参照答案：通过特定的酶切位点容许外源DNA片断插入的载体；容许外源DNA片断替代载体的非必须DNA片断的载体17.λgt10是一种由λ噬菌体衍生而来的insertionvectors，重要用于（）。它缺失了具有溶源整合的（）；λgt11载体也是一种insertionvectors，该载体的最大特点是在最左侧可替代区置换了一段（）基因，可编码β-半乳糖苷酶，在IPTG/X-gal平板上可形成（）色噬菌斑。参照答案：克隆小的cDNA；b257；lacZ；蓝18.λ噬菌体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，其总的DNA长度应当在噬菌体genome的（）范围内。78%～105%19Cosmid实际上是由（）和（）构成的杂合载体，也可以说是带有（）序列的质粒。cos位点；质粒；cos20.染色体步查指（）。采用一段分离自某一重组体一端的非反复DNA片段作为探针以鉴定具有相邻序列的重组克隆。21Cosmid的构成包括三个部分：（），（）和（），其中复制子来源于（），cos序列来源于（）。质粒复制起点；cos位点；抗性标识；质粒；噬菌体22.λ噬菌体的最大克隆片段是（）kb，Cosmid的最大克隆片段可到达（）kb。23；4523.运用λ噬菌体载体构建的genelibrary中，文库是以（）的形式存在的；用质粒载体构建的genelibrary是以（）的形式存在的；粘粒载体构建的genelibrary是以（）的形式存在的。噬菌斑；菌落；菌落24.M13噬菌体颗粒是（）状的，其基因组为（）（填单或双）链DNA。它只感染（）性大肠杆菌，感染宿主后来，其噬菌体颗粒的释放不像λ噬菌体那样要裂解宿主菌，而是（）。丝；单；雄；从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒25.M13噬菌体仅有两个大的基因间隔区，分别位于（）与（）之间以及（）和（）之间，这些基因间隔区内具有（）的元件。其中，（）称为IG区，它有三个最重要的功能即（），（）和（）。参照答案：Ⅷ；Ⅲ；Ⅱ；Ⅳ；调整基因体现和DNA合成；GeneⅡ和GeneⅣ之间的间隔区；具有可对包装及DNA在病毒颗粒中的定向进行调控的顺式作用因子；正链与负链DNA合成起始和终止位点；不依赖与ρ因子的转录终止信号26.RFDNA是指（）。参照答案：复制型DNA，感染性的单链噬菌体DNA（正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链DNA，用于DNA的复制。27.M13K07辅助噬菌体是（）的衍生株，它带有一种来自（）的复制起点，还带有一种来自（）的卡那霉素抗性基因，用作选择标识；基因Ⅱ带有一种（）的突变，导致基因蛋白质第40位氨基酸由甲硫氨酸变为异亮氨酸。参照答案：M13phage；p15A；Tn903；G-T28.YAC载体基本构成元件有（），（），（），（）和（）。参照答案：复制起点；着丝粒；端粒；MCS；筛选标识29.体现载体（Expressvector）是在常规载体的基础上衍生而来的，其构建的原理重要是增长一种（），以及有助于体现产物的分泌、分离或纯化的元件；穿梭载体（Shuttlevector）是指（）体现元件；可以在两类不一样宿主中复制、增殖和选择的载体三．选择题1.氨苄青霉素的工作原理为（）A可以克制细胞壁肽聚糖的合成点评：B、D为四环素的工作原理；C为氯霉素的工作原理2.pUC18与pUC19的区别在于（）B两者的多克隆位点方向相反点评：系列载体的区别一般不大，重要是克隆方向或读码框等方面的差异。3.载体所具有的特点中，如下描述不恰当的是（）参照答案：D必须具有较高的拷贝数，便于制备点评：对于那些有剂量限制的基因克隆需要使用低拷贝的质粒载体4.复制子由三部分构成，如下不属于的为（）D启动子点评：理解质粒的生物学性质。5.pBluescriptM13载体在多克隆位点的两侧引入了T7和T3两个噬菌体的启动子，这样增长了该载体的功能，如下4种功能哪一种是不对的的（）参照答案：D运用这两个启动子进行定点突变点评：理解pBluescriptM13载体的工作原理及特性。6.以粘粒为载体转染受体菌后，平板上生长的菌落会出现大小不一、生长速度不一的现象，其原因是（）D重组体中插入片段的大小不一样点评：插入片段自身的复制以及插入片段在宿主菌中的体现产物都会影响宿主的生长。7.噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的重要构造是（），而来自噬菌体的重要构造是（）A，A重组体中插入片段的大小不一样点评：理解噬菌粒的生物学特性。8.野生型的M13有10个基因，分为三个功能基团，其中与复制有关的两个基因是（）A基因Ⅱ；基因Ⅳ点评：熟悉M13噬菌体的遗传学性质。9.M13单链噬菌体的复制分为三个阶段，如下哪一项不属于此（）DSS→SS点评：RFDNA特指M13单链噬菌体复制型双链DNA10.λ噬菌体DNA和M13单链噬菌体DNA在成熟前的DNA复制类型为（）A滚环复制模型点评：λ噬菌体DNA和M13单链噬菌体侵染宿主后，都是先θ复制模型，后转为滚环复制模型。11.如下对pUC18的描述中，错误的为（）C可以在辅助质粒的协助下合成单链DNA点评：pUC18没有IG区，不也许形成单链。12.如下对粘粒为载体的重组体的描述对的的是（）B各重组体在平板上生长的速度不一样，转化子中插入片段的扩增量也是不一样的点评：理解粘粒载体的工作原理。13.下列哪种克隆载体对外源DNA的装载量最大（）B酵母人工染色体（YAC点评：人工染色体包括YAC、BAC、PAC等，其特点是可以装载大的（100kb以上）外源DNA片段。14.同一种质粒DNA，以三种不一样的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是（）参照答案：BSCDNA>LDNA>OCDNA点评：DNA分子构造越紧凑，泳动时受到的阻力越小，迁移速率越大。15.有关穿梭质粒载体，下面哪一种说法最对的（）参照答案：A在不一样的宿主细胞中使用不一样的复制起点点评：可以在两类不一样的宿主中复制、增殖和选择的载体称为穿梭载体。16.反向反复序列：（）C可以回折形成发夹构造17.λ噬菌体线性DNA分子的两端各有一种（）个碱基构成的天然黏性末端参照答案：B12点评：λ噬菌体线性DNA分子的两端各有一种12个碱基构成的天然粘性末端，称为cos位点。18.下列有关细菌人工染色体（BAC）的特点描述，除（）以外都是对的的参照答案：BBAC载体在大肠杆菌中为高拷贝点评：细菌人工染色体。是基于大肠杆菌的F质粒构建的高通量低拷贝质粒载体。包括严谨型控制的复制区oriS、启动DNA复制的由ATP驱动的解旋酶（RepE），以及三个保证低拷贝并使质粒精确分派至子代细胞的基因座（parA，parB和parC）等元件。19.粘粒（cosmid）是一种人工建造的载体，下列对它的描述中哪一项是不对的的（）D进入受体细胞后，可引起溶源化反应点评：粘粒指带有将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的cos序列的质粒。包括质粒复制起点，可以像质粒同样转化并增殖；包括cos位点，可以像噬菌体颗粒同样包装、侵染。20.松弛型质粒：（）A在寄主细胞中拷贝数较多点评：理解松弛型质粒的概念。21.有关质粒的不相容性，下列哪一种说法对的（）参照答案：C假如两个质粒不相容，阐明它们的复制机制相似点评：运用同一复制系统的两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不波及DNA限制系统时出现的现象。22.一般状况下，质粒的存在状况如下描述对的的是（）A独立存在点评：质粒指细菌或某些低等生物里面存在的独立于染色体外的双链闭合环状DNA分子（目前也发既有线状的），它常常携带某些不必需的遗传信息。23.转座子不包括下列哪个部分（）D反复序列点评：理解转座子的概念。24.下列哪一项不是质粒载体必备的基本特性（）D含lacZ点评：lacZ是一种筛选标识，可以使载体使用的愈加以便，但不是载体的必需元件。25.质粒的消失和染色体的突变是不一样的，表目前（）参照答案：A前者不能恢复，后者可以通过答复突变恢复该基因的性状点评：理解答复突变。26.如下的描述中，哪一项是对的的（）参照答案：C假如细菌的某种表型特性在UV处理下丧失后不再恢复，这种表型有也许是质粒赋予的点评：理解质粒的生物学性质及质粒载体的工作原理。27.线性质粒复制的引物来自于（）参照答案：D自身末端的端粒序列点评：参照染色体的复制。28.下面有关松弛型质粒的性质描述中，（）是不对的的A一般带有抗性标识点评：氯霉素可以增长质粒的复制，而不影响染色体的复制。29ColE1是唯一用作遗传工程载体的自然质粒，如下对这种质粒描述不对的的是（）B具有四环素抗性点评：ColE1是自然质粒，没有四环素抗性基因，不能通过抗性筛选30.如下不是体现载体所必须的条件是（）C启动子不需要受控制点评：体现载体与克隆载体相比就是多了体现所必须的多种遗传元件。四.简答题1.何为载体？一种理想的载体应具有那些特点？参照答案：将外源DNA或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具有：①在宿主细胞内必须可以自主复制（具有复制原点）；②必须具有合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同步不影响其复制；③有一定的选择标识，用于筛选；④其他：有一定的拷贝数，便于制备。2.含pMB1或（ColE1）复制子的plasmid是怎样复制的，其调整机制怎样？参照答案：复制方式：在复制时，首先合成前RNAⅡ，即前引物，并与DNA形成杂交体；而后RnaseH切割前RNAⅡ，使之成为成熟的RNAⅡ，并形成三叶草二级构造。该引物引导质粒的复制。调整机制：形成的RNAⅠ可控制RNAⅡ形成二级构造，同步Rop增强RNAⅠ的作用，从而控制质粒的拷贝数。减弱RNAⅠ和RNAⅡ之间互相作用的突变，将增长带有pMB1或（ColE1）复制子的拷贝数。3.当向细菌培养基中加入氯霉素时，可以使细菌质粒的拷贝数得到扩增，试分析其原理？参照答案：pMB1质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依托宿主提供的半衰期较长的酶（DNA聚合酶Ⅰ，DNA聚合酶Ⅲ），依赖于DNA的RNA聚合酶，以及宿主基因dnaB、dnaC、dnaD和danZ的产物。因此，虽然存在克制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素时，带有pMB1（或ColE1）复制子的质粒将继续复制，最终每个细胞中可积聚2～3千个质粒。4.抗性基因（Resistantgene）是目前使用的最广泛的选择标识，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例阐明其原理？参照答案：氨苄青霉素抗性基因（ampr）、四环素抗性基因（tetr）、氯霉素抗性基因（Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（kanr,neor）以及琥珀突变克制基因supF。青霉素克制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，克制转肽反应并克制其活性。Ampr编码一种酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化β-内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。四环素与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而克制核糖体的转位。Tetr编码一种由399个氨基酸构成的膜结合蛋白，可制止四环素进入细胞。5.何为α-complement？怎样运用α-complement来筛选插入了外源DNA的重组质粒？参照答案：α-complementation指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α-complementation是基于在两个不一样的缺陷β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现α-complement重要有两部分构成：LacZ△M15，放在F质粒或染色体上，随宿主传代；LacZ'，放在载体上，作为筛选标识，当在LacZ'中插入一种片断后，将不可防止地导致产生无α-complement能力的β－半乳糖苷酶片断。在诱导物IPTG和底物X-gal（同步可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的β－半乳糖苷酶，不能分解X-gal，展现白色，而含非重组质粒的菌落则展现兰色。以此到达筛选的目的。6.为何野生型的λ噬菌体DNA不适宜作为基因工程载体？参照答案：①野生型噬菌体DNA没有容载能力，由于噬菌体的头部对DNA包装的量是有限制的，不能不小于基因组的105％，因此要将λ噬菌体改导致载体，必须削减分子量；②野生型的λ噬菌体对于某些常用的酶均有多种识别和切割位点，不便于克隆；③没有可供选择的标识；④野生型的λ噬菌体具有感染性，因此不够安全。7.试简述λ噬菌体的Lyticgrowth和Lysogenicstate两种循环的分化及其调整过程？参照答案：Lyticgrowth是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解。Lysogenicstate为λ噬菌体基因组DNA通过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA中随宿主的繁殖传到子代细胞。调整过程：由感染复数和细胞的营养状态决定的，感染复数越高，营养状态越差，则溶源化的频率就越高。溶源现象的生化媒介也许是3'--5'cAMP，它在细胞内的浓度会随营养条件的变化而变化，当细胞在富营养培养基中生长时，cAMP的浓度较低，有助于裂解生长；在缺乏cAMP的突变细胞中，更有助于裂解生长此外一种重要的调整原因是噬菌体的CⅡ蛋白，它是噬菌体基因转录的激活子，克制裂解功能基因的体现，催化噬菌体DNA整合到细菌的染色体中去。高浓度的CⅡ蛋白增进溶源化，而低浓度的CⅡ蛋白增进裂解生长。当CⅡ蛋白浓度足够时，激活CⅠ蛋白和基因int的体现，导致噬菌体DNA与染色体整合，朝着溶源态生长。8.用λ噬菌体载体进行genecloning时，重要运用λ噬菌体的生物学特性作选择标识，其中有cI失活和Spi筛选，请问什么叫cI筛选？什么叫Spi筛选？参照答案：CⅠ蛋白控制溶源态的形成，裂解生长受到克制，当外源基因片段插入cⅠ中，cⅠ蛋白失活，溶源态打破而进入裂解生长而筛选出重组克隆，叫做cⅠ筛选。野生型噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性E.coli中的生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感（sensitivetoP2interference）。假如λ噬菌体缺乏两个参与重组的基因red和gam，同步带有chi位点，并且宿主菌为rec+，则可以在P2溶源性E.coli中生长良好，噬菌体的这种表型称作Spi-。因此，通过λ噬菌体载体DNA上的red和/或gam基因的缺失或替代，可在P2噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组λ噬菌体。9.简述λ噬菌体载体的克隆原理及一般环节？参照答案：λ噬菌体载体属于克隆载体，重要用于克隆DNA片断。工作原理：λ噬菌体载体克隆外源DNA片断的原理与质粒载体的工作原理是类似的，只是在形式上有许多差异。载体和外源DNA片断通过酶切后，外源DNA片断插入到载体的合适位置，或置换载体的填充片段。这种连接后的重组DNA保留增殖性能，但由于分子量太大，不能象重组质粒DNA那样可通过转化措施进入大肠杆菌。通过提取λ噬菌体的蛋白质外壳，可在体外将重组噬菌体DNA进行包装，形成噬菌体颗粒。这样的噬菌体颗粒保留对大肠杆菌的感染能力，可将被包装的重组噬菌体DNA注射到宿主菌中。通过裂解生长，可增殖重组噬菌体。克隆环节：①通过裂解过程增殖载体；②载体与外源DNA的酶切；③外源DNA与载体的连接；④重组噬菌体的体外包装；⑤包装噬菌体颗粒的感染；⑥筛选。10.Cosmid的工作原理是什么？参照答案：粘粒载体的重要原理类似λ噬菌体载体。在外源片断与载体连接时，粘粒载体相称于λ噬菌体载体的左右臂，cos位点通过粘端退火后，再与外源片断相间连接成多联体。当多联体与λ噬菌体包装蛋白混合时，λ噬菌体A基因蛋白的terminase功能将切割两个cos位点，并将两个同方向cos位点之间的片断包装到λ噬菌体颗粒中去。这些噬菌体颗粒感染大肠杆菌时，线状的重组DNA就象λ噬菌体DNA同样，被注入细胞并通过cos位点环化。这样形成的环化分子具有完整的粘粒载体，可象质粒同样复制并使其宿主获得抗药性。因而，带有重组粘粒的细菌可用含合适抗生素的培养基挑选。通过这种方式，就将外源DNA片断通过粘粒载体克隆到大肠杆菌中去了。11.构建粘粒文库时会碰到哪些问题？你怎样处理？参照答案：运用粘粒构建基因文库时会碰到许多困难：①载体分子会自身连接，从而导致效率大大减少甚至失败。通过对载体作去磷酸化处理或使用双cos位点载体或对载体的酶切产物进行部分补平可处理这一问题；②多种外源片断插入载体中，会误将两个本来不相连的DNA片断认为是基因组中的持续DNA片断。通过搜集35～45kb的部分酶切外源DNA片断与载体连接、使用双cos位点载体或对载体和外源片断的酶切产物进行部分补平，可处理这一问题。③提取的基因组DNA长度不不小于200kb，将使部分酶切后形成的35～45kb片断只有少部分在其两端带有酶切位点，致使目的DNA的可用性大大减少。在对外源DNA片断作部分酶切之前，应检查其大小，假如不不小于200kb则不能用于构建文库；④提取的总DNA纯度不高，也许由于出现酶解克制物而得不到理想的酶切产物。因此，在制备总DNA时，应小心防止混入的有机相和水相交界处的物质。假如问题仍旧出现，可用氯化铯梯度离心措施纯化DNA或重新制备总DNA；⑤在构建的文库中常常出现不含外源片断的克隆。这种“空”克隆的比例依载体的不一样和操作的小心程度而不一样一般而言，使用单cos位点的载体，约有5％的克隆是空的。使用双cos位点的载体，产生空克隆的比例要低得多；⑥不一样重组质粒拷贝数可以有很大差异，导致收获量相差悬殊。每当对文库作一次噬菌体的扩增，这些差异将会被深入放大；⑦尽管文库似乎全面，但也许不能获得目的克隆。限制酶位点的非随机分布、包装蛋白污染限制酶、重组引起的序列缺失和扩增时目的克隆也许被淘汰等都是产生这种现象的原因。12.丝状噬菌体克隆中常常会碰到哪两类问题？可用何种措施来处理？参照答案：①外源DNA区段的部分缺失，克隆于丝状噬菌体基因间隔区的外源基因趋于不稳定。外源基因越大，缺失突变率越高，尽量防止带有让感染细菌在液体培养中持续生长，可以使这种现象减少到最低程度（尽管不能完全消除）。对的的做法是，用保留于－70℃的重组噬菌体原种转染合适的宿主菌，铺成平板，并从分隔良好的单个噬斑的中央挑取细菌进行小规模培养；②13.噬菌粒（Phagemid）具有那些特性？许多phagemid均有一种重要的缺陷，即在辅助噬菌体感染后，有时候单链DNA的产量较低且反复性一般较差，试分析其原因？参照答案：①双链DNA既稳定，又高产，具有常规质粒的特性；②免却了将外源DNA片断从质粒亚克隆于噬菌体载体；③由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。原因：①噬菌体携带的基因间隔区确实切序列，携带完整基因间隔区的质粒可由于干扰辅助病毒DNA复制而克制子代噬菌体颗粒的产生；②基因间隔区插入质粒的详细位置，基因间隔区插入pBR322HindⅢ位点所构成的噬菌粒，会严重干扰野生型噬菌体的生长，而将基因间隔区插入AhaⅢ位点则否则；③辅助噬菌体的性质，野生型丝状噬菌体及其抗干扰突变株都被用作辅助噬菌体。辅助噬菌体基因间隔区插入了lacZ序列，因而基因Ⅱ产物对它的识别不那么有效；④克隆于噬菌粒的外源DNA的大小与性质，因外源DNA片断的大小而异，单链DNA的产量可以在5～10倍之间有所差异（一般来说，外源DNA越大，产量越低）。此外，由于某些尚不清晰的原因，大小相似的外源DNA，其单链DNA的产量也参差不齐。14.YAC载体具有什么样的功能性元件？为何它在克隆大片段时具有很大的优越性？参照答案：YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一种着丝粒，一种复制起点，两个端粒。YAC可以容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和粘粒办不到的。大片断的插入更有也许包括完整的基因，在染色体步移中每次容许更大的步移距离，同步减少完整基因组文库所需的克隆数目。思索题问题：作为一种最基本的载体，它必须具有哪些功能元件？思索题问题：何为α-互补？在载体构建中有何作用？思索题问题：请简要描述?噬菌体溶原状态和裂解循环的基因调控模式，及其在构建载体中的作用。思索题问题：简述M13K07辅助噬菌体的遗传学特性和生物学功能，及其在制备单链DNA中的作用。第四章一.名词解释1.TAEbuffer醋酸缓冲液。由Tris碱、醋酸和EDTA等成分构成的缓冲体系，用于琼脂糖凝胶电泳。2.SDS十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。用于检测蛋白质分子量的电泳措施，待分离蛋白质是变性的，泳动速率只与分子量有关，与自身所带电荷无关。3.SouthernblotSouthern杂交。一种检测DNA分子的措施。将DNA片段从琼脂糖凝胶转移到滤膜，结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂交液进行预杂交，然后与标识的核酸探针和滤膜混合。假如滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。在通过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去后，通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上与否存在与探针同源的DNA分子及其分子量。4.NorthernblotNorthern杂交。用于检测细胞或组织样品中与否存在与探针同源的mRNA分子的检测措施。过程与Southern杂交相似，只不过在Blotting过程中转移的是RNA而不是DNA。5.WesternblotWestern杂交。用来检测细胞或组织样品中与否存在能被某抗体识别的蛋白质的措施。将蛋白质样品从SDS凝胶通过电转移方式转移到滤膜，通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上与否存在被抗体识别的蛋白质，并判断其分子量。所用的探针不是DNA或RNA，而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体。6.Colonyhybridization菌落杂交。