生物化学：第10章DNA的生物合成-本科

基因信息的传递第三篇基因：编码生物活性产物的DNA功能片段。基因信息的横向传递和纵向传递。基因信息的相同决定了形态的相似。

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中心法则(thecentraldogma)

——Click，1958

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逆转录本篇主要内容1、第十章：复制（replication）2、基因表达第十一章：转录（transcription）

第十二章：翻译（translation）3、第十三章：基因表达调控4、第十四章：基因工程（geneticengineering)（geneexpression)DNA的生物合成(复制)DNABiosynthesis(Replication)

第十章本章内容1.DNA复制的基本规律；2.DNA复制的酶学和拓扑学变化；3.DNA的生物合成过程4.逆转录和其他的复制方式；5.DNA的损伤和修复DNA复制的基本规律BasicRulesofDNAReplication第一节半保留复制(semi-conservativereplication)双向复制

(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)高保真性DNA复制的基本规律复制(replication)： 遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA子链继承母链遗传信息的几种可能方式:

全保留式半保留式混合密度梯度离心实验低高轻重——实验结果支持半保留复制的设想。Messelson，1958含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液

第一代继续培养于普通培养液

第二代梯度离心结果重氮DNA普通氮DNA混合氮DNA不是全保留式不是混合式一、半保留复制是DNA复制的基本特征DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代DNA中，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。两个子代DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的概念:AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制过程中形成的复制叉子代DNA半保留复制按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础。二、双向复制复制时，DNA从起始点（origin）向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制（bidirectionalreplication)复制中的放射自显影图象复制叉DNA双链解开分成两股，各自作为模板，子链沿模板延长所形成的Y字形结构。CCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTG真核生物：•染色体DNA有多个复制起始点。•从一个DNA复制起始DNA复制区域称为复制子(replicon)。•复制子是独立完成复制的功能单位。5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制3’13k～900k真核生物多个复制起始点、复制子与复制叉原核生物DNA复制的特点•基因组是环状DNA；•只有一个复制起始点

——复制体（Replisome）；

oriterABC3

5

3

5

3´5´3´5´解链方向领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)三、复制的半不连续性3´5´顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的这股链称为领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。冈崎片段：

•1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为冈崎片段。

•原核生物:1000~2000个核苷酸

•真核生物:100~200个核苷酸动画：半不连续复制3.kenzakyfragment.flv四、复制的高保真性DNA复制的精确度极高，误差率很低，保证物种维持遗传信息的保守性。1、DNA聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；2、遵守严格的碱基配对规律；3、复制出错时，DNA聚合酶的即时校读功能。半保留复制双向复制半不连续复制高保真性小结：DNA复制的基本规律

第二节DNA复制的酶学复制的化学反应

(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

聚合反应的特点新链DNA的

生成需引物和模板；新链DNA的延长只可沿5→3

方向进行。DNA复制的体系底物:dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)模板:解开成单链的DNA母链引物:提供3'-OH末端的寡核苷酸聚合酶:依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-pol)其酶和蛋白质因子:拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、连接酶一、DNA聚合酶全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol活性：(1)5

3

的核苷酸聚合活性

(2)核酸外切酶活性核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。3

5

外切酶活性:5

3

外切酶活性:能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。5´

AGCTTCAGGATA

3´|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´?核酸外切酶功能:

3

5

外切酶活性:5

3

外切酶活性:能切除引物或突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。（一）原核生物的DNA聚合酶分为三型DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢDNA聚合酶Ⅰ——A.Kornberg，1955～1958

在DNA链上沿5’→3’方向的延长（DNA聚合酶活性）从3’端水解DNA链（3’→5’核酸外切酶活性）从5’端水解DNA链（5’→3’核酸外切酶活性）只能催化20个核苷酸左右DNA聚合酶Ⅰ：结构特点:109kD，单一多肽链，含有18个alpha-螺旋肽段；从N端到C端有3个酶促活性结构域，依次排列：5′→3′外切酶、3′→5′外切酶和DNA聚合酶。功能：对复制中的错误进行校读；对复制和修复中出现的空隙进行填补；对引物、突变片段进行切除；323个氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是分子生物学研究中常用的工具酶。

DNA-polⅡ（120kD）具有5’→3’的聚合酶活性；具有3’→5’核酸外切酶活性DNA-polII基因突变型菌株仍然可以存活；DNA-polII对模板的特异性不高；可能参与DNA损伤的应急状态修复。DNA-polⅢDNA聚合酶Ⅲ是多亚基组成的蛋白质。DNA聚合酶Ⅲ全酶由α、β、γ、δ、ε等10种不同的亚基组成。DNA-polⅢ(250kD)功能：每分钟可以催化多至105次聚合反应。结构特点：

核心酶（αεθ）α亚基：5′→3′聚合酶活性ε亚基：3′→5′外切酶活性和碱基选择功能，是复制保真性所必需β亚基：夹稳模板链并使酶沿模板链滑动γ－复合物：促进全酶组装至模板及增强核心酶活性E.Coli中的DNA聚合酶（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

起始引发，有引物酶活性。复制的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

真核生物的DNA聚合酶

真核生物的DNA聚合酶DNA复制的保真性的酶学基础1、DNA聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能，遵守严格的碱基配对规律；2、DNA聚合酶具有的核酸外切酶活性执行即时校读功能。二、与复制起始及解链相关的酶类及蛋白（1）DnaA蛋白(识别复制起始位点）（2）DnaB蛋白（解螺旋酶）（3）DnaC蛋白（4）DnaG蛋白（引物酶）（5）SSB（单链DNA结合蛋白）E.Coli基因图3000kbDnaA蛋白DnaA蛋白是由相同亚基组成的四聚体。复制起始时，DnaA蛋白辨认并结合E.coli上复制起始点oriC，10~20个DnaA蛋白相互靠近形成DNA蛋白质复合体结构，促使oriC局部解链。p250复制起始点（E.coli-oriC）GATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATTACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串联重复序列反向重复序列5

3

5

3

识别区AT富含区DnaB蛋白解螺旋酶，利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。DnaBDnaC解链方向p250DnaC蛋白DnaC蛋白的作用是将具有解链酶活性的DnaB蛋白运送到复制模板，并协同DnaB蛋白的作用。p250DnaG－引物酶依赖DNA的RNA聚合酶。可以催化游离NTP聚合。催化RNA引物的生成。引物（primer）：是由引物酶催化生成的短链RNA，它可为DNA聚合提供3'-OH末端。p250DnaB、DnaCDnaG（引物酶）DnaA蛋白复合物

单链DNA结合蛋白SSB作用：复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整模板的DNA总要处于单链状态，而DNA分子只要符合碱基配对，又总会有形成双链的倾向，以使分子达到稳定状态和免受胞内广泛存在的核酸酶降解。

拓扑结构——解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。三、拓扑异构酶108局部解链后DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链。正超螺旋既能水解、又能连接磷酸二酯键

拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ拓扑异构酶分类：拓扑异构酶作用特点：拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。（主要）作用机制

四、DNA连接酶连接DNA链3

-OH末端和相邻DNA链5

-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。注：连接碱基互补基础上的双链中的单链缺口。DNA连接酶(DNAligase)作用方式：3

5

3

5

解链方向3´5´3´3´5´HO5’3’3’5’DNA连接酶ATP（NAD+）AMP5’3’5’3’在复制中起接合单链缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。DNA连接酶的功能供核糖3

-OH提供5

-P结果DNA聚合酶引物或延长中的新链游dNTP去PPi(dNMP)n+1连接酶复制中不连续的两条单链不连续→连续链拓扑酶切断、整理后的两链改变拓扑状态DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3

,5

-磷酸二酯键生成的比较

小结：参与DNA复制的酶和蛋白质DNA聚合酶；DNA解旋酶；拓扑异构酶；引物酶；单链结合蛋白；复制因子等；DNA生物合成过程TheProcessofDNAReplication第三节本节内容1原核生物的DNA生物合成2真核生物的DNA生物合成一、原核生物DNA生物合成（一）复制的起始（二）复制的延长（三）复制的终止1、DNA解链2、引发体的形成并合成引物3、超螺旋的转型（一）复制的起始DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶OHSSB3

5

3

5

引物酶OH5

3

3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子引物3'HO5'引物酶含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体.复制起始的过程1．DnaA蛋白辨认结合oriC的重复序列，并与DNA形成复合物，引起局部解链；2．DnaB在DnaC的辅助下结合于初步打开的双链，并用其解螺旋酶活性开链；3．拓扑酶通过切断、旋转和再连结的作用，实现DNA超螺旋的转型；4．SSB结合在已开链的DNA模板上，使DNA在一定的范围内保持开链状态。5．引物酶介入，形成的引发体，可按照模板的配对序列，催化NTP的聚合，生成引物。（二）复制的延长过程：领头链连续复制，随从链不连续复制复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链的3’-OH上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol顺着解链方向而生成的子链，复制是连续进行的,这股链称为领头链.随从链在延长时，又要等到下一段暴露出足够长而度的模板，再次生成引物而延长。这就是不连续复制。1.复制叉汇合：原核生物基因组是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。（三）复制的终止过程2.切除引物、填补空缺、连接切口；5

5

5

OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATPADP+Pi5

5

DNA连接酶

随从链上不连续性片段的连接：引物真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。二、真核生物的DNA生物合成

哺乳动物的细胞周期DNA合成(synthesis)期G1G2SM人为分成起始、延长、终止三个阶段真核生物的DNA生物合成复制起始需要的酶和因子DNA-polδ（聚合酶和解螺旋酶活性）拓扑酶复制因子（RFC)增殖细胞核抗原（PCNA)：DNA聚合酶δ的辅助蛋白

DNA-polα(引物酶活性)真核生物复制的延长发生DNA聚合酶α/δ转换DNA-polδ和polα分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-polδ通过PCNA的协同作用，逐步取代polα，在RNA引物的3

-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由polα催化合成。然后由PCNA协同，polδ置换polα，继续合成DNA子链。3

5

5

3

领头链3

5

3

5

亲代DNA随从链引物(RNA+DNA)核小体复制的延长复制的终止染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后会留下空隙。引物切除产生空隙5‘…3'3‘…5'LinearDNA:RNAprimerUpstreamOkazakifragment线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。功能•维持染色体的稳定性•维持DNA复制的完整性结构特点•由末端DNA序列和蛋白质构成。•末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒(telomere)

指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。端粒酶(telomerase)端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。端粒酶的分子结构端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

组成：端粒酶的爬行模型（动画演示）DNA聚合酶复制子链进一步加工端粒及端粒酶的意义体细胞端粒比胚胎细胞端粒短；老化与端粒酶活性下降有关；肿瘤的发生与端粒酶活性有关

正常细胞：细胞分裂细胞分裂

衰老死亡

细胞年轻化

端粒酶重新引入抗衰老细胞分裂细胞分裂细胞衰老端粒酶永生化抗肿瘤靶点1、起始2、延长3、终止（注意原核生物与真核生物的不同）DNA复制的一般过程逆转录和其他复制方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays第四节逆转录

(reversetranscription)在逆转录酶的催化下，以RNA为模板合成DNA的过程，又称反转录。RNADNA

逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶

Humanimmunodeficiencyvirus，HIVAcquiredImmuneDeficiencySyndrome--AIDSRNAviruse逆转录酶(reversetranscriptase)

有三种活性：RNA指导的DNA聚合活性

RNaseH活性(水解RNA)

DNA指导的DNA聚合活性逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链单链DNA逆转录酶双链DNA逆转录酶逆转录病毒RNA病毒的基因组是RNA而不是DNA，其复制方式是逆转录，故称为逆转录病毒（retrovirus）。RNA病毒感染活细胞后，要先经逆转录成为双链DNA，通过基因重组方式，参加入宿主细胞基因组，并随宿主细胞复制和表达。这种重组方式称为整合（integration）。病毒基因的整合可能是病毒致癌的重要方式。分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。

以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。试管内合成cDNAcDNAcomplementaryDNA逆转录酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTTHIVLifeCycle1=EntryinCD4+lymphocytes2=Reversetranscription3=Integration4=Transcription5=Translation6=ViralAssembly二、逆转录的发现发展了中心法则逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。

逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。

DNA损伤（突变）与修复DNADamage(Mutation)andRepair第五节一、突变的定义二、突变的意义三、引发突变的因素四、引起突变的分子机制五、DNA损伤的修复突变(mutation)：个别脱氧核糖核苷酸残基甚至片段DNA在构成、复制或表型功能上的异常变化，称为突变，也称为DNA损伤（DNAdamage）。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。

p259一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（二）DNA多态性:只有基因型改变的突变（三）突变导致死亡药物赖药性（四）突变是某些疾病的发病基础突变乳腺癌总结：突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（二）DNA多态性:只有基因型改变的突变（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础二、引发突变的因素（1）自发性:自然错配率约为10-9～10-10

左右。（2）物理因素:UV、各种辐射。CTX-raychestviewatomicbomb物理因素：

紫外线(ultraviolet,UV)、各种辐射

UV胸苷二核苷酸胸苷酸二聚体（3）化学因素:

化工原料（EB），食品添加剂，亚硝酸盐等。（4）生物因素:黄曲霉素和病毒等。回顾：引发突变的因素自发性:自然错配率约为10-9～10-10

左右。物理因素:UV、各种辐射。化学因素:化工原料，食品添加剂，亚硝酸盐等。生物因素:黄曲霉素和病毒等。三、引起突变的分子改变类型有多种错配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)

框移(frame-shift)

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逆转录DNA分子上的碱基错配称点突变(pointmutation)。点突变发生在基因的编码区，可导致氨基酸改变。（一）错配导致的氨基酸的改变正常成人Hb(HbA)β亚基N-val

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his

·

leu

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thr

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pro·

glu

·

glu

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·

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C肽链CTCGAG基因镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)β亚基N-val

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his

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leu

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thr

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pro·

val

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glu

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·

C肽链CACGTG基因1949年波林发现镰刀型细胞贫血症（病人的红血细胞为镰刀形）与血红蛋白结构异常相关。（二）缺失、插入和框移缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。

缺失或插入都可导致框移突变

。5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙缬