植物组织培养技术基础实验

10首先介绍本学期共有5个小试验，分为2大类，三项试验，1类是植物组织培育，另1类是动物细3个小试验，即试验一：植物组织培育技术根底试验；实验二：MS2个小试验，分别其次项试验，是试验四：动物细胞培育液的配制与灭菌；第三项试验，试验五：动物细胞的组织块培育。提出试验要求，留意试验各项内容的安全，包括试验试剂的使用，试验室的使用，试验仪器的使用，试验动物的处理等。下面开头学习试验一。一、试验目的：了解植物组织培育试验室的设置及根本设备，学习根本仪器设备的使用原理与方法，把握植物组织培育的一些根本技术。二、试验内容：〔一〕组培试验室的设置一个标准的组织培育试验室应当包括：预备室、接种室、培育室、驯化室等，预备室又称为化学试验室或通用试验室，可由洗涤室、培育基配制室和灭菌室构成。在实际中可结合可行条件，合并一局部。各分室能满足试验预备〔器皿的洗涤与存放、培育基制备和无菌操作、用具的灭菌〕、无菌操作和掌握培育三项根本工作的需要。1、预备室由洗涤室、培育基配制室和灭菌室构成。洗涤室(cleaningroom)用于玻璃器皿和试验用具的洗涤、枯燥和贮存；培育材料的预处理与清洗；组培苗的出瓶、清洗与整理等。室内应配备大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。备有塑料筐，用于运输培育器皿。备有枯燥架，用于放置枯燥涮净的培育器皿。培育基配制室用于培育基的配制。〔池〕，保证上下水道畅通。有时可将配制室内部间隔为称量分室和配制分室。规模较小时，配制室可与洗涤室合并为预备室。仪器与用具配置：电子分析天平、托盘天平、磁力搅拌器、蒸馏水器、酸度计、恒温水浴锅、电炉〔或微波炉、电饭煲、液化气炉灶等〕、冰箱等仪器设备；移液管〔或微量移液器〕、移液管架、培育瓶〔包括试管〕、棕色或透亮、烧杯〔带或不带刻度〕、量筒、容量瓶、培育皿、吸管、打孔器、玻璃棒、标签纸、记号笔、耐高温高压塑料薄膜等封口材料、周转筐、尼龙绳、脱脂棉、纱布、工作台、蒸馏水桶、医用小推车等用品和用具。此外，配备器械柜和药品柜，分别存放接种用具和分类存放化学试剂〔可改为药品〕。最好配备防尘设备，以削减灰尘污染。灭菌室用于培育基、器皿、工具和其他物品的消毒灭菌。要求安全、通风、光明；墙壁和地面防潮、耐高温；配备水源、水槽〔池〕、电源或煤气加热装置和供排水设施；保证上下水道畅通，通风措施良好。生产规模较小时，可与洗涤室、配制室合并在一起，但灭菌锅的摆放位置要远离天平和冰箱，而且必需设置换气窗或换气扇，以利通风换气。仪器与用具配置：高压灭菌锅、干热消毒柜或烘箱、细菌过滤装置、工作台、培育基存放架或橱柜、周转筐、换气扇、医用小推车等。2、无菌操作室〔transferingroom〕进展植物材料的接种、培育物的转移等无菌操作，因此接种室也称为无菌操作室。其无菌条件的好坏对组织培育的成功与否起着重要作用。在工作便利的前提下，接种室宜小不宜大，一般7～8m2，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置推拉门，以削减开关门时的空气扰动。接种室要求干爽安静，清洁光明。在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照耀灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，削减与外界空气对流。酒精灯、广口瓶、三角瓶、搪瓷盘、接种工具、手持喷雾器、工作台、搁架、接种用的小平车、不锈钢长方形饭盒(盛放70～75%酒精，用于浸泡接种工具)或医院用消毒盒等。配置污物桶，以便存放接种过程中的丢弃物，须每天清洗更换。进入无菌室前，为了防止带菌空气直接进入接种室和工作人员进出接种室时带进杂菌，接种人员在缓冲间更衣、换鞋、洗手、戴上口罩后，才能进入接种室。应当在此室内安装灭菌用的紫外灯。3、培育室〔culturingroom〕培育室是将接种的材料进展培育生长的场所。培育室的大小可依据需要培育架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节约能源为原则。高度比培育架略高为宜，四周墙壁要求有绝热防火的性能。5、6l0-20cm，其他每层间隔30cm左右，培育架即高1.7m左右。培育架长度都是依据日光灯的长度而设40W1.3m，30Wlm60cm。培育室最重要的因子是温度，一般保持在20～27℃左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培育室。室内湿70％～80％为好，可安装加湿器。掌握日光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10～16h也有的需要连续照明。现代组培试验室大多设计为承受自然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节约能源，而且组培苗承受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。4、驯化室驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿掌握仪、喷雾器、光照调整装置、通风口以及必要的杀菌剂。〔二〕组培试验室常用仪器设备1、常用仪器设备超净台最常用最普及的无菌操作装置,主要通过风机,送入的空气经过细菌过滤装置,再流过工作台面.因此,超净工作台应放置在空气干净,地面无灰尘的地方,以延长使用期.使用过久,引起堵塞,需要清洗和更换过滤器。本试验室配置的是：苏州净化设备VS-1300L双人单面净化工作台高压灭菌锅是最根本的设备，用于培育基.器械等的灭菌。本试验室配置的是：上海申安LDZX-4Ⅱ立式自动电热压力蒸汽灭菌锅空调机保证室内温度，一般为25±2℃，应安置在室内较高的位置。以便于排热散凉。本试验室配置的是：上海日立家用电器公司KFR-72QW/G3光照培育箱用于植物材料的特定培育，可以掌握温度、湿度及光照等。本试验室配置的是：常州国华电器250-D光照培育箱烘箱80-100℃为宜．假设需干热灭菌，温度上升至150-1601-3小时即可．本试验室配置的是：上海森信试验仪器DGG-9620A电热鼓风枯燥箱冰箱某些试剂．药品和母液需低温保存，有些材料需低温处理，需要使用冰箱本试验室配置的是：青岛海尔股份BCD-219BSV电子分析天平和托盘天平电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品准确度为0.0001g；托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，其准确度为0.1g。天平应放置在枯燥、不受震惊的天平操作台上。本试验室配置的是：上海周密科学仪器2104N电子天平显微镜及解剖镜，种类较多，用于分别微茎尖可承受双筒实体解剖镜。双筒解剖镜在分别茎尖等较小组织时，便5-8040操作，要有照明装置。解剖镜上带有照相装置，依据需要随时对所需材料进展摄影记录。摇床与转床用于改善液体培育材料的通气状况及促进酶解原生质体的解离。一般在液体培育中转速为每分10080磁力搅拌器磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质、琼脂粉等。磁力搅拌器还可加热，使之更利于溶解。本试验室配置的是：常州国华电器88-179-2培育架进展固体培育和试管苗大量生殖时,需要有放置培育瓶的培育架。本试验室配置的是：济南普朗特科技高效节能培育架酸度计组织培育中培育基pH值的准确度是格外重要的，应当使用酸度计，假设无酸度计，也可使用pH试纸进展粗测。本试验室配置的是：上海世仪周密仪器FSH-3C酸度计离心机用于收集原生质体，转速要求较低。一般为1000～4000rpm即可。〔三〕必要的器皿1、玻璃器皿长时间培育和贮存药液用的玻璃器皿，要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成，而且能够耐高压灭菌。培育器皿装入培育基进展植物材料的培育，依据培育目的和要求不同，可以承受不同种类和规格的玻璃器皿。试管、三角瓶〔或锥形瓶〕、培育皿。通常以纱布包被棉花塞，外面再包一层牛皮纸，用线绳或橡皮筋扎好。现在多承受聚丙烯塑料薄膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样经济便利，且通气好。也可承受专用的封口膜。以到达防止培育基枯燥和杜绝污染的目的。目前，培育容器和制备培育基所需的玻璃器皿渐渐被塑料器皿所代替。塑料容器具有质轻、透亮、不易裂开、本钱低等优点，如培育容器多为平底方盒形，可提高培育空间利用率的植株数，并能一层层地叠摞起来，从而节约空间。这类塑料制品多是承受聚丙烯材料制成，能耐高温，可进展高压灭菌。有些产品为一次性消耗品，不但可节约洗涤人工，还可节约时间，提高效率。一次性塑料容器或带螺丝帽的玻璃瓶，无须另外配盖，使用时比较便利。盛装器皿配制培育基时，各种药品的溶解，储藏均需要各种规格的烧杯、等。大烧杯用于培育基的熔化，本钱高，易破，可以用搪瓷盆代替。计量器皿母液的配制、药液的分装、吸取需要玻璃计量器皿，如10ml、25ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1000ml的量筒，25ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1000ml、2000ml的容量瓶，以及0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml的移液管，用于配制培育基时吸取不同种类的母液。应多预备几支，分开使用。其他器皿：如滴瓶、称量瓶、玻璃棒、漏斗、玻璃管、注射器等试验室常用器皿应具备。2、金属器械组织培育常用的金属器械，可选用医疗器械或微生物试验所用的器械。镊子类常应用医疗上的镊子。依据操作需要有各种类型，假设用l00ml的三角瓶作为培育瓶，可用20em长的镊子。镊子过短．简洁使手接触瓶口，造成污染。镊子太长，使用起来不敏捷。剪刀类可承受医疗五官科用的中型剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。也可以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进展剪切。解剖刀切割较小材料和分别茎尖分生组织时，可用解剖刀。刀片要常常调换，使之保持锐利状态，否则切割时会造成挤压，引起四周细胞组织大量死亡，影响培育效果。接种针用来转移细胞和愈伤组织。〔四〕试验用具的洗涤和灭菌1、器皿的清洗植物组织培育最重要的，也是最根本的要求，就是各项操作都应从无毒害、无污染的培育环境来考虑。培育过程中最常常、最大量的工作之一，是洗涤培育瓶及其它常用器皿。在清洗器皿处应有较大的水池，水池应用水泥制作，白瓷砖砌内外外表，池底另放一张橡胶垫，以削减器皿破损。自来水龙头宜承受三孔鹅颈式的，用水便利，并在需要时可加装抽滤器。下水道应畅通，以免阻碍工作。除水池外，还需关心以假设干盆与桶。最常用的洗涤助剂就是家庭用的洗衣粉及肥皂两种，备一点去污粉也有些用处。假设冷的洗衣粉水效力欠佳，可以增加浓度或适当加热。这已可以处理很多清洗中的问题。没必要使用铬洗液，由于使用这种洗液要格外留神，而且效率也不高。洗瓶时先将瓶子在清水中泡一会儿，然后在水龙头下涮去瓶内污物，沥干水，泡入浓洗衣粉水中，再用瓶刷沿瓶壁上下刷动和呈圆周旋转两4次，以彻底冲去洗衣粉残留物。洗好的瓶子应透亮锃亮，内外壁水膜均一，不挂水珠，即表示无污迹存在。通常无须乎再用蒸馏水涮一遍，直接置于搁架上沥晾水汽。也可制作晾洗架，瓶子倒放在孔格中或挂在小木棍上，这样洗后要摆一遍瓶子，用时再收一次瓶子。急等使用的瓶子可以用烘箱烘干。烘时缓慢升温，温度也无须太高。买进的瓶子亦可按上述方法处理。移液管之类的仪器，可用橡皮吸耳球)和热洗衣粉水吸洗，再放水龙头下流水冲净，垂直放置晾干。带刻度的计量仪器不宜烘烤，以免玻璃变形，影响计量的准确度。如洗后急等使用，只要用要吸量的液体吸弃数次，或95%酒精吸弃数次后，即可使用。2、灭菌〔1〕器皿和用具常用灭菌方法：热压灭菌法〔学习操作〕将洗净的培育器皿，用具，用牛皮纸包好，放入高压消毒锅中，1.120－30干热灭菌法洗净的玻璃器皿置于电热枯燥箱中，150℃40分钟或120℃两小时，待冷却后使用。〔二〕无菌室灭菌〔接种室、培育室〕1、用洁尔灭擦抺工作台，70%酒精擦拭超净工作台。2、薰蒸〔学习操作〕1－3110ml/m2。2：甲醛〔HCHO〕与高锰酸钾〔KMn〕10：14370－75%酒精喷雾，使飘在空气中的尘埃沉积下来。4、用紫外光灯进展照耀灭菌〔波长2650－2660A〕30－40〔三〕培育基灭菌〔略〕〔四〕培育材料灭菌〔略〕〔五〕工作人员无菌操作〔略〕三、作业1、参观我系组培试验室，分组争论，提出问题及改进意见。2、每人刷洗三个组培瓶和两套培育皿，为后续试验做预备。试验二MS一、试验目的：通过MS方法。二、试验内容：MS培育基含有近30种养分成分，为了避开每次配制培育基都要对这几十种成分进展称量，可将培育基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培育基母液。可分为大量元素母液、微量元素母液、有机物质母液〔维生素、氨基酸等〕、铁盐母液和激素类母液五种。配制母液有2点好处：一是可削减每次配制称量药品的麻烦，二是削减极微量药品在每次称量时造成的误差。这样每次使用时，取其总量的1/20〔50mL〕或1/200〔5mL〕，加水稀释，制成培育液。现将制备培育基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。〔一〕MS成分分子量使用浓度(mg/L)硝酸钾 KNO3101.111900硝酸铵 NH4NO380.041650大量元素磷酸二氢钾 KH2PO4136.09170硫酸镁 MgSO4.7H2O246.47370氯化钙 CaCl2.2H2O147.02440微量元素碘化钾 KI166.010.83硼酸 H3BO3 61.836.2硫酸锰MnSO4.4H2O223.0122.3硫酸锌ZnSO4.7H2O287.548.6钼酸钠Na2MoO4.2H2O241.950.25硫酸铜CuSO4.5H2O249.680.025氯化钴CoCl2.62237.930.025乙二胺四乙酸二钠Na2.EDTA乙二胺四乙酸二钠Na2.EDTA372.2537.3铁盐硫酸亚铁FeSO24.7H2O278.0327.8肌醇100甘氨酸2有机成分盐酸硫胺素VB10.1盐酸吡哆醇VB60.5烟酸VB5或VPP0.5蔗糖sucrose342.3130g/L琼脂agar7g/L1、大量元素(母液Ⅰ)mg／L〔0.5mmol／LN、P、K、Ca、S、Mg。配时要留意以下几点：a.各化合物必需充分溶解后才能混合。b.混合时留意先后挨次，特别要将钙离子与硫酸根离子，磷酸根离子错开，以免产生硫酸钙、磷酸钙等不溶性化合物沉淀，钙离子最终参加。c.混合时要慢，边搅拌边混合〕NH4NO333000KNO338000CaCl2·2H2O8800MgSO4·7H2O7400KH2PO434002、微量元素(母液Ⅱ)〔0.5mmol／LFeB、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl要留意顺次溶解后再混合，以免沉淀。硫酸根可用一个烧杯〕KI166H3BO31240MnSO4·4H2O4460ZnSO4·7H2O1720Na2MoO4·2H2O50CuSO4·5H2O5CoCl2·6H2O53、铁盐(母液Ⅲ)〔铁盐必需单独配制：将称好的FeSO4·7H2ONa2-EDTA·2H2O450mL边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，混合时可置于加热搅拌器上不断搅拌混合直至溶液呈金黄色〔约20-30分钟，将pH调至5.，最终定容到1FeSO4〕FeSO4·7H2O5560Na2-EDTA·2H2O74604、有机成分(母液Ⅳ)〔易配，依次参加即可〕ⅣA肌醇20000ⅣB100盐酸吡哆醇(维生素B6)100盐酸硫胺素(维生素B1)100甘氨酸400以上各种养分成分的用量，除了母液Ⅰ为20200倍浓缩液。1L的贮备液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最终定容到1L。5、激素MS培育基中还需要参加吲哚丁酸IB、萘乙酸NA6-苄基嘌呤6B〕等植物生长调整物质，并且分别配成母液1mg/m。其配制方法是：分别称取这3种物质各50m，将IBA用少量〔1mL〕95%乙醇预溶，用蒸馏水定容至50ml；将6BA〔1mL〕1mol/LHCL〔不好融，约30分钟，用蒸馏水定容至50m；NAA用少量1m1mol/L的NaOH溶液溶解，用蒸馏50ml。〔三〕母液的保存1、装瓶将配制好的各母液分别倒入瓶中，贴上标签，注明母液号、配制倍数、配制日期等。2、贮存：将各母液瓶放入冰箱内低温保藏。〔四〕培育基的配制1、配制培育液50mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB5mL6BA2mL，NAA1ml配制培育液时应留意：①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，假设觉察瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应马上淘汰这种母液，重进展配制；②用量筒或移液管量取培育基母液之前，必需用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的挨次写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。溶化琼脂7g30g1000mL750mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透亮状。然后再将配好的混合培育液参加到煮1000mL，搅拌均匀。pH1mol/LNaOHpH〔5.4～7.0〕pHpH5.8〔培育基的pH必需严格掌握在5.。4、分装溶化的培育基应当趁热分装。分装时，先将培育基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培育基倒入锥形瓶(50mL100mL)中。留意不要让培育基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培育基的量约为锥形瓶1/5～1/41000mL25～30培育基分装完毕后，应准时封盖瓶口。用29c9cm1牛皮纸封盖瓶口，并用线绳捆扎。最终在锥形瓶外壁贴上标签。〔五〕培育基的灭菌24h内灭菌。灭菌过程如下：加水；装锅；盖盖；加热；排放冷空气；升压保温；降压排气；出锅冷却。三、作业1、分组配制培育基。2、灭菌时留意将培育基、无菌水、试验用的器材都灭菌四、留意事项1、在1套培育皿里加上滤纸，以吸干植物材料的水分。2、用专用于组培的镊子、解剖刀。一、试验目的：把握植物组织培育时外植体无菌体系建立的方法。二、试验内容：1、外植体预处理：剪取三叶草的幼嫩茎段2～3cm，去掉外面的老叶，在自来水下流水清洗10分钟；27030S0.15min3～531cm左右带有一个腋芽的茎段，翻开培育瓶盖子用经过灭菌的镊子将外植体置于培育容器内，接种到培育基上。接种时动作尽量要快，应使形态学上端向上，防止倒置。然后盖上盖子并拧紧(或塞上塞子)写上接种日期和学生姓名即转入培育室内培育，室内温度252000LUX14三、作业：观看并记录现象。一、试验目的：把握动物细胞培育的方法，二、试验内容：〔一〕细胞培育室的设置和无菌操作细胞培育技术与其他一般试验室工作的主要区分在于要求保持无菌操作，避开微生物及其他有害因素的影响。一般标准的细胞培育室应包括配液室、预备室和培育室。培育室内要完全密闭，保持恒定稳定，在设计上要：培育室的位置最好设在阴面，阳光不能直射，防止室内温度增高。天花板高度不超过2米，保证紫外灯有效杀菌。常用拉门，以防止空气流淌。天花板、地板、墙壁光滑无死角，可镶瓷砖或涂油漆，不易在墙角堆灰尘。〔二〕设备双蒸水蒸馏器，酸缸，枯燥箱，高压锅，贮存柜，天平，pH计，磁力搅拌器，超净工作台，冰箱，CO2培育箱，离心机，CO2钢瓶，液氮罐，紫外灯，倒置显微镜〔三〕仪器0.22微米微孔滤膜，75%乙醇，0.1%洁尔灭。(四)清洗玻璃器皿的清洗步骤：按浸泡→刷洗→浸酸→冲洗等四步程序进展。①浸泡：购进的玻璃器皿常带有灰尘，呈弱碱性，或带有铅、碑等有害物质，故先用自来水浸泡过夜、水洗，然后再用2%~5%盐酸浸泡过夜或煮沸30min，水洗。要领：培育用后的玻璃器皿要马上泡入清水中，使下道刷洗工作能顺当进展。用后的玻璃器皿常带有大量的蛋白质附着，枯槁后不易刷洗掉，用后要马上用清水浸泡。②刷洗：用软毛刷、优质洗涤剂，刷去器皿上的杂质，冲洗晾干。要领：浸泡后的玻璃器皿用毛刷pH上升的趋势，所以易选用软毛刷和优质洗涤剂。制止用去污粉。因其中含有砂粒。会严峻破坏玻璃器皿的光滑度。特别留意刷洗瓶角部位。酸浸之前要把洗涤剂冲干净。③浸酸：将器皿浸泡于清洁液24h，如急用也不得少于4h。清洁液由重铬酸钾、浓硫酸及蒸馏水配制而成，具有很强的氧化作用，去污力量很强。经清洁液浸泡后，玻璃器皿残留的末刷洗掉的微量杂质可被完全去除。10min10次以上。然后再经蒸馏水漂洗330min或放3%盐酸中浸泡过夜，未污染者可不需灭菌处理，但仍要刷洗、清洁液浸酸过夜，冲洗等。塑料器皿清洗自来水充分浸泡→冲洗→2%NaOH浸泡过夜→自来水冲洗→2%~5%盐酸浸泡30min→自来水冲洗→蒸馏水漂洗3次→晾干→紫外线照耀30min(或先用75%酒精浸泡、擦拭，再用紫外线照耀30min)。凡能耐热的塑料器皿，最好经101.3kPa(121.3℃)高压灭菌。胶塞等橡胶类处理购置者先经自来水冲洗→2%NaOH煮沸15min→自来水冲洗→2%~5%HCl煮沸15min→自来水冲洗5次以上→蒸馏水冲洗5次以上→蒸馏水煮沸10min，倒掉沸水让余热烘干瓶塞等。或蒸馏水冲洗晾干，整齐摆放于小型金属盒内经101.3kPa高压灭菌。金属器械的清洗购进的金属器械常涂有防锈油，先用沾有汽油的纱布擦去油脂，再用水洗净，最终用酒精棉球擦10min，或包装好以101.3kPa高压15min。除菌滤器的处理用过的滤器将滤膜去除，用三蒸水充分洗净剩余液体，置枯燥箱中烘干备用。2．包装包装的目的是防止消毒灭菌后再次患病污染，所以经清洗烤干或晾干的器材，应严格包装后再行消毒灭菌处理。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。包装分为局部包装和全包装两类，前者用于较大瓶皿，一般用硫酸纸和牛皮纸将瓶口包扎好；后者适于较小培育瓶皿、吸管、注射器、金属器械和胶塞等，以下为常用瓶皿、吸管、无菌衣帽等的包装方法，其它物品可参照处理。①瓶类：硫酸纸罩以瓶口,外罩二层牛皮纸用绳扎紧。②小瓶皿、胶塞、刀剪等器械可装人饭盒，饭盒再以牛皮纸包好，绳扎好。③吸管、滴管口用脱脂棉塞上(不要太紧或太松)装人消毒筒内，滤器、滤瓶、橡皮管等都要用牛皮纸包好瓶口等，外罩一层牛皮纸包好，再用包布包好。④无菌衣、帽、口罩，均以牛皮纸或包布包好，绳扎好。3．消毒灭菌严格的消毒灭菌对保证细胞培育的成功是极为重要的，其方法分为物理法和化学法两类。前者包括干热、湿热、滤过、紫外线及射线等，后者主要指使用化学消毒剂等。①热灭菌：玻璃器皿，160~170℃，90~120min或180℃45~60min。②蒸气灭菌：用于玻璃器皿、滤器橡胶塞、解剖用具、耐热塑料器具、受热不变性的溶液等，不同物品其有效灭菌压力和时间不同，如培育用液、橡胶制品、塑料器皿等用68kPa(115℃)高压灭菌10min；布类、玻璃制品、金属器械等用103kPa(121.3℃)高压灭菌15~20min。0.22μm微孔滤膜可除去细菌和霉菌等，用此滤膜过滤两次，可使支原体到达某种程度的去除，但不能除去病毒。200~300nm，最强是在254nm，6~152.5m以下，湿度45%~6030分钟的照耀时间。⑤熏蒸消毒：当遇有细胞培育消灭屡次污染，或试验室两个月一次的常规消毒，均可用高锰酸钾5-7.5g，加甲醛〔40%〕10-15ml，混合放入一开放容器内，马上可见白色甲醛烟雾，消毒房间需封闭24h，至少4h以上。⑥煮沸消毒：严密状况时使用，金属器械和胶蹇在水中煮20~30分钟，趁热倾去水分即可使用。用具及洗手用的溶液均常用化学药品进展消毒杀菌。常用的有：2%煤酚皂溶液〔来苏尔〕、0.25%洁尔灭、1%升汞、3~5%甲醛溶液、75%酒精。(五)配置培育液组织培育使用的培育基一般是由合成培育基和小牛血清配制而成。合成培育基有商品出售，它是依据细胞生长的需要按肯定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其它关心物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相像。小牛血清含有肯定的养分成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子、激素、贴附因子等，这是合成培育基无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。故一般体外培育细胞时要参加肯定量的小牛血清〔10%〕。11套，蒸馏器，高压蒸汽灭菌锅，磁力搅拌器，pH计。材料：500mL、250mL盐水瓶，250mL500mL培育液瓶，0.22m的微孔滤膜。试剂：双蒸水，小牛血清，合成培育基DMENaHC。操作过滤器的预备和安装0.22m的微孔滤膜，用布包装好，1520min进展高压蒸汽灭菌处理。在超净工作台内安装好过滤装置，预备过滤。合成培育基的配制1/31/3保证全部干粉都溶解成培育液。搅拌使其溶解。将干粉溶于4503.7gNaHCO3。100U/ml100μg/ml80万U/瓶，4ml1000ml0.5ml100U/ml100U/5ml1000ml0.5ml100μg/ml。④调整培育液的pH7.2~7.4。⑤1000毫升容量瓶定容。⑥过滤法除菌。⑦分装于玻璃瓶中，4℃冰箱保存备用。⑧使用时加血清。小牛血清的处理市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体。将血清放入56℃水浴中30min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。4．生长培育基的配制除无清培育之外，各种合成培育基在使用前需要参加肯定量的小牛血清〔约10%5．Hank’s①称取Hank’sNacl8.00g，Kcl0.40g，Cacl0.14g，NaHCO0.35g，KHPO0.06g，MgSO·2 3 2 4 47HO0.20g，NaHPO·2HO0.06g，葡萄糖1.00g，0.1%酚红1ml。2 2 4 2②配置Hank’s液时，需将Cacl2

100ml的蒸馏水中，溶解后再参加Cacl2

溶液。700ml蒸馏水中，溶解后再参加CaCl2溶液。④用NaHCO3调整pH7.0～7.21000mL。⑤121℃，30min4℃保存。也可以按上述方法配制成10倍浓度的母液，4℃保存，使用时按倍数稀释成工作液。6．DMEM培育液①在室温下〔20℃～30℃〕700ml三蒸水溶解培育基干粉，轻轻搅拌，不要加热。②三蒸水冲洗包装袋的内部，转移全部的痕迹干粉到容器内。2.0gNaHCO3到培育液中，参加青霉素与链霉素双抗。④通过缓慢搅拌参加1mol/LNaOH或1mol/LHCl调整p〔7.～7.pH在抽滤时会上升0.～0.3，因而调整pH7.0～7.1最正确。⑤用三蒸水定容后，搅拌溶解，留意不要过分搅拌。4℃静置完全溶解后，在超净台内抽滤分装，短期使用保存在2℃～815d应保存于-20℃。⑦使用前按比例参加血清10～20。〔六〕灭菌1、配置好的Hank’s12130min2、试验用的工具〔镊子、解剖刀、手术剪、直剪21素小瓶中加装滤纸片，吸管、过滤器放入滤膜用布包好，灭菌3、留意事项培育液配好后，要先抽取少许放入培育瓶内在37℃温箱内置24—48h，以检测培育液是否有污染。然后再用于试验。较多同一批号的血清，这样试验条件稳定，配液时调整pH值较易。每次配液量以使用两周左右的量为宜。一次配液不要太多，一是养分成分有损失，二是简洁污染。试验五动物细胞的组织块培育一、试验目的把握动物细胞培育方法二、试验原理组织块培育是常用的、简便并且成功率较高的原代培育方法，马上组织剪切成小块后，直接接种于培育瓶。培育瓶可依据不同细胞生长的需要作相应处理。例如为了利于上皮样细胞等细胞的生长，可以在生长面预先涂上胶原薄层。假设原代细胞预备做组织染色以及电镜等进一步检查，可在原代培育之前先在培育瓶内放置清洗干净的盖玻片。并在放入组织块前预先用1-2滴培育液潮湿瓶底，使盖玻片固定在瓶底。组织块培育法操作简洁，局部种类的组织细胞在小块贴壁培育24h后，就有细胞从组织块四周游出。但由于