hplc法测定复方利血平片中氢氯噻嗪、盐酸异丙嗪和利血平的含量

hplc法测定复方利血平片中氢氯噻嗪、盐酸异丙嗪和利血平的含量

复合利血平片（也称为复合抗高血压片）是临床常用的抗高血压药物，主要由四种成分组成：利血平、羟氯仿吡啶和盐酸异丙基吡啶。现行国家标准中只对其中几种成分进行定性分析,无含量测定项,不利于该药的质量控制。为了进一步提高完善该品种质量标准,本文成功建立了用HPLC法测定复方利血平片中氢氯噻嗪、盐酸异丙嗪和利血平的含量方法,取得了较为满意的结果。1勒托利多ae小鼠天平Agilent1200高效液相色谱仪;G1329A自动进样器;G1314B可变波长检测器;AgilentChemStationB.03.02工作站;梅特勒托利多AE240电子天平(0.01mg)。氢氯噻嗪、盐酸异丙嗪、利血平对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号分别为100309-200702、100422-200501、100041-200311,纯度分别为99.8%、100%、100%),复方利血平片为市售(产地分别为江苏、上海、江西,批号分别为08031816、080302、080307,每片含氢氯噻嗪3.1mg、盐酸异丙嗪2.1mg、利血平32μg),庚烷磺酸钠、乙腈为色谱纯,水为二次蒸馏水,其他试剂为分析纯。2方法和结果2.1ll-1戊烷磺酸钠乙腈三乙胺体系Shim-PackVP-ODS-C18色谱柱(150mm×4.6mm×5μm);流动相:0.01mol·L-1庚烷磺酸钠∶乙腈∶三乙胺(53∶47∶0.1),用磷酸溶液调节pH至5.5;流速1.0ml·min-1;进样量10μl;柱温30℃;检测波长:0.00~1.85min为380nm,1.86~3.20min为241nm,3.21~5.00min为275nm,5.01~7.00min为230nm。2.2溶液的制备和系统适用性的试验2.2.1对照品贮备液的制备分别精密称取105℃干燥4h的氢氯噻嗪对照品、105℃干燥2h的盐酸异丙嗪对照品、利血平对照品,用流动相溶解,制成每1ml中含氢氯噻嗪4.8355mg、盐酸异丙嗪3.375mg、利血平49.125μg的溶液,作为对照品贮备液。精密量取贮备液2ml,置10ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。2.2.2适血量的测定取本品20片,精密称定,研细,精密称取适量(约相当于利血平0.1mg),置10ml量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,即得。2.2.3阴性对照溶液按处方组成比例,取除氢氯噻嗪、盐酸异丙嗪、利血平外的其余药品,按工艺要求,制成不含氢氯噻嗪、盐酸异丙嗪、利血平外的阴性对照样品,再按供试品溶液的制备方法,制成阴性对照溶液。2.2.4保留时间的确定分别取对照品溶液、样品溶液、阴性对照溶液,注入液相色谱仪,按“2.1”项下条件测定,如图1。由图可知,在此色谱条件下,各组分分离良好,分离度均大于4.5,理论板数以利血平计均不小于3000,其他组分对氢氯噻嗪、盐酸异丙嗪、利血平的测定无干扰,满足试验要求。对照品溶液3个组分的保留时间分别为:氢氯噻嗪2.067min、盐酸异丙嗪3.634min、利血平5.973min;样品溶液3个组分的保留时间分别为:氢氯噻嗪2.067min、盐酸异丙嗪3.711min、利血平6.081min,保留时间一致,试验专属性较好。2.3线性回归分析精密吸取对照品贮备液1、3、5、10、15ml,分别置25ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,照上述色谱条件测定,记录色谱图,以主成份峰面积A为纵坐标,进样浓度C(g·L-1)为横坐标,进行线性回归,结果氢氯噻嗪浓度在0.1934~2.9013g·L-1范围内线性关系良好,回归方程为A=3282.23C+122.683,r=0.9999;盐酸异丙嗪浓度在0.135~2.025g·L-1范围内线性关系良好,回归方程为A=2746.82C+8.99534,r=1.0000;利血平浓度在1.965~29.475mg·L-1范围内线性关系良好,回归方程为A=33.1961C-0.00590062,r=1.0000,结果见表1。2.4进样稳定性测定精密吸取“2.2.1”项下的对照品溶液,重复进样6次,分别测定氢氯噻嗪、盐酸异丙嗪、利血平的峰面积,RSD均小于2.0%,结果见表2。2.5氢氯噻嗪、盐酸异丙嗪、利血平平均含量的rsd取同一批号(江苏08031816)样品6份,按样品溶液制备方法处理,在上述色谱条件下测定,结果氢氯噻嗪、盐酸异丙嗪、利血平平均含量的RSD分别为0.53%、0.56%、0.37%(n=6),结果见表3。表明样品溶液重复性良好。2.6供试品的稳定性测定取制备好的样品溶液(江苏08031816),在上述色谱条件下测定,每间隔4h测定一次,结果测得的供试品中氢氯噻嗪、盐酸异丙嗪、利血平的峰面积积分值在12h内比较稳定,RSD分别为0.29%、0.17%、0.58%(n=4),结果见表4。2.7血平对照品回收率取已知含量的样品(江苏08031816)适量,分别加入一定量的氢氯噻嗪、盐酸异丙嗪、利血平对照品,按样品溶液制备方法制备,在上述色谱条件下测定,氢氯噻嗪平均回收率为100.44%,RSD为0.8%(n=9);盐酸异丙嗪平均回收率为100.25%,RSD为1.2%(n=9);利血平平均回收率为100.73%,RSD为1.1%(n=9),结果见表5。2.8样品测定分别取不同厂家及批号的样品,按上述方法及条件测定。按外标法计算含量,结果见表6。3复方利血平片中各组分含量测定由于所测样品中的3个组分中,氢氯噻嗪以及盐酸异丙嗪的量与利血平的量相差悬殊,所以根据各组分的出峰时间,在不同区域采用不同的检测波长,从而达到调节各组分峰高比例的效果。由于三个组分性质差异较大,经实验摸索得知:单纯的用醇水组合为流动相出峰时间不理想;流动相加入无机盐调pH后氢氯噻嗪和盐酸异丙嗪分离效果不好;经过细微调节组分的比例以及pH值,最终选定流动相加入离子对试剂调pH,各组分峰形较