环磷腺苷葡氨和氨茶碱联用对小鼠急性缺氧性脑损伤的干预作用

环磷腺苷葡氨和氨茶碱联用对小鼠急性缺氧性脑损伤的干预作用

缺氧和窒息是一种非常常见的病理生理过程。缺氧发生后，损伤最严重的是中枢神经系统，尤其是婴儿。近年来研究表明在脑损伤急性期,脑组织内环磷腺苷(cAMP)水平显著下降,其参与了脑缺氧损伤的病理机制。MCA和氨茶碱可防止缺氧引起的cAMP下降,提高细胞内cAMP水平。本实验采用急性缺氧性脑损伤(HBI)小鼠模型,探讨MCA、氨茶碱及两药联合应用对HBI的神经保护作用及可能机制。材料和方法1.氨茶碱组MCA(黑龙江江世药业有限公司);氨茶碱(广州白云山明兴制药有限公司);SOD、MDA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。2.小鼠的瓶塞观察3周龄昆明小鼠90只(购自南方医科大学动物中心),雄性,体重18-22g,放入含有新鲜空气、经过标定的广口瓶中,瓶内预置10g钠石灰,以涂凡士林的瓶塞密封,观察小鼠的表现,当小鼠出现呼吸困难时打开瓶塞。3.测定指标及方法小鼠随机分为正常对照组、HBI组、MCA组、氨茶碱组、MCA+氨茶碱组,每组18只(其中6只测脑组织含水量,6只测生化指标,6只用于病理切片);MCA组予浓度为MCA5mg/kg+生理盐水5ml/kg,氨茶碱组予氨茶碱5mg/kg+生理盐水5ml/kg,合用药组予氨茶碱5mg/kg+MCA5mg/kg,HBI组注射等量的生理盐水,各组采用腹腔注射给药,2次/日,72h后断头取脑,取材测各项指标。4.湿重的测定鼠断头取脑后,滤纸擦去表面残血,在电子天平上称出湿重后,置80℃恒温干燥箱中至恒重,再称干重。根据以下公式计算脑组织含水量:脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重X100%。5.sod和mda断头取脑称重,用无菌生理盐水作为匀浆介质,按1g:9ml在冰浴中充分匀浆,离心后取上清,SOD采用黄嘌呤氧化酶法测定,MDA应用改良的硫代巴比妥酸法测定,操作按说明书进行。6.海马组织形态观察断头取脑,分离海马组织,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片,片厚5微米;HE染色,普通光镜下观察海马组织形态变化;400倍显微镜视野下观察,以周围出现卫星现象的细胞为调亡细胞,计数6个视野内调亡细胞数。7.统计学处理方法实验数据以x¯±sx¯±s表示,采用SPSS13.0统计软件对数据进行方差齐性检验、单因素方差分析,比较组间差异;两两比较采用LSD法,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异非常显著。结果1.各组脑的含水量比较与正常对照组相比,氨茶碱组可明显减少脑组织含水量,合用组次之。药物干预组脑组织含水量减轻较HBI组减轻。(见表1)2.组不同高度的时域适用差异合用组MDA的含量与正常对照组比无显著差异;与HBI组相比,药物干预组脑组织内MDA的含量明显降低,以两药合用最明显(见表1)。3.近覆盖近覆盖与正常对照组相比,合用组SOD的活性最接近正常值;与HBI组相比,药物干预组脑组织中SOD活性明显升高,以两药合用为著(P<0.01),但仍低于正常水平(见表1)。4.各组脑组织病理学变化(1)大量缩亡细胞,观察细胞病变HBI组海马结构紊乱,细胞排列散乱,可见大量萎缩及调亡细胞,胶质细胞增生;MCA组、氨茶碱组海马病理改变较HBI组减轻,尤以两药合用组为显著,见下图。(2)两组调亡细胞数变化HBI组海马CA1区细胞凋亡数显著增加;药物干预组调亡细胞数减少,其中,联合用药组较单一用药组调亡细胞数明显减少(P<0.01,P<0.01)。促进细胞调亡作用近来的研究表明脑缺氧时存在脑组织cAMP的代谢紊乱,其参与了脑缺氧/缺血损伤的病理机制。缺氧时,脑组织短暂的缺氧缺血即可引起ATP的急骤减少;另一方面由于严重的缺氧也可损害腺苷酸环化酶系统,使腺苷酸环化酶的活性降低或受抑。两者共同作用使细胞内cAMP水平下降。Pourcyrous研究了窒息后脑脊液中cAMP的变化规律,认为窒息后前20mincAMP迅速增至基线3倍以上,20-40min时降至基线,恢复早期(60min时)cAMP又有所上升,随着继续恢复,cAMP降至基线值50%左右而不再变化。cAMP作为第二信使参与神经系统的调节:如窒息早期提高细胞内cAMP可使脑血管扩张,改善缺血区的供血,调节脑血管的舒缩功能;促进神经元的存活与抗调亡作用;参与抗炎作用;参与中枢神经系统的突触传递过程与学习与记忆过程。MCA是cAMP的新型衍生物,其脂溶性高,易进入细胞;氨茶碱是黄嘌呤类衍生物,是非特异性磷酸二酯酶抑制剂,可延缓cAMP的降解,有助于较长时间维持cAMP水平,达到间接提高细胞内cAMP水平的作用。当窒息极期脑血管自主调节紊乱,脑血流过渡灌注时,氨茶碱可使血管收缩,减少缺血后反应性充血,防止脑过度灌注,减轻脑水肿。另一方面氨茶碱还有改善通气功能,强心利尿,抗炎的作用。本实验结果提示两药合用可有效抑制脑组织内氧自由基生成,减轻细胞毒性脑水肿,尤其在改善急性缺氧性脑损伤的病理结构与抑制细胞调亡方面较单一用药组效果更好。推测可能与两药合用治疗急性缺氧性脑损伤具