植酸的提取分离与检测

植酸的提取分离与检测

植物含有六醇六磷酸酯（ip6），广泛分布于新鲜食物，如谷物、豆类、干果、蔬菜和水果中。由于粮食、谷类、谷类和玉米中的单宁含量高。植酸能与金属离子Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+等结合,形成不溶于水的络合物。由于植酸有多个不同结合部位,可以结合不同种类和数目的金属离子,这就使植酸的定性分析与定量检测变得复杂。植酸的定量分析通常包括植酸的提取分离和检测两步。1超声接头振荡提取提取和分离主要是将植酸从待检样品中提取并使之与样品中其他成分分离,为进一步进行定性或定量检测奠定基础。植酸的提取主要是利用其可溶于稀酸溶液的特性进行的。目前提取用酸主要是盐酸(HCl)和三氯乙酸(TCA)。对食物或生物样品的液相提取可以用HCl,无需对样品进行脱脂处理。TCA通常用来对生物组织进行提取,因为它可使蛋白质变性,从而使植酸释放出来。但是,此提取方法的过滤过程会因蛋白质的吸附作用而损失一部分植酸。一般情况下,为了使植酸完全从待检样品中溶解到提取液中,需要较长的提取时间,因此检测效率较低。Lehrfeld采用超声探头振荡提取,大大缩短了提取的时间,由2~3h缩短为1~3min,也使开展大量检测成为可能。提取后植酸的分离则主要是为了去除同时提取出的杂质,离心、冷冻、解冻、分离方法包括沉淀法、固相萃取(交换柱分离)以及蒸发等方法,这些方法的主要目的是沉淀分离植酸类物质,沉降或者置换凝胶物质、可溶性蛋白质及无机磷,浓缩肌醇磷酸酯。固相萃取主要采用离子交换柱的形式,交换柱采用的介质可以是硅胶阴离子交换剂SAX也可以是阴离子交换树脂AG1-X8。前者测定结果较后者稍高,但SAX柱的变异系数较小(分别为19.4%和17%),二者的回收率相似;SAX柱的优势在于预处理的时间较短,应用的pH值范围较广(1~14),而且可重复性、再现性强。Cilliers和vanNiekerk以及Harland提出的高效液相色谱(HPLC)法,在分离提取时进行了离心、过滤,省略了采用离子交换去除无机磷的步骤,采用植酸与柱后反应剂的特异性反应而排除了其他物质对检测结果的干扰,这也使植酸的提取和分离变得相对简单。2植物酸的检测2.1传统紫外吸光法定性检测是分析植酸及低级肌醇磷酸酯的一个主要难点。植酸的分子结构决定了植酸不吸收可见光或紫外光,因而不能使用传统的紫外吸光测定法。常用的定性检测方法是HPLC折射率法。这种方法的主要缺点是由于不能进行梯度洗脱,因此不能区分肌醇磷酸酯的异构体;而且,该方法灵敏度偏低,检测结果易受环境温度波动的影响。2.2定量分析植酸定量分析早期的方法有氯化铁沉淀法和阴离子交换色谱法,随着离子对HPLC法和毛细管电泳法的发展,这些新方法也被应用。2.2.1铁离子沉淀沉淀法的原理是植酸在弱酸性条件下与铁离子生成稳定的不溶物质,植酸可能是唯一具有该特性的磷酸盐。经过消化或水解后,测定沉淀物中磷的含量,可得到IP6的含量。IP6与铁离子的比值为3∶1时即可形成沉淀,高于此比例时更是如此,IP6与未沉淀的铁离子之间有一定的化学计量关系。其他不同的方法同样都是以分析Fe-IP6中的磷和铁为基本原理的。沉淀法的缺点是对IP6及其部分脱磷酸类似物的鉴别缺乏特异性。Sandberg等发现IP3~IP6都可与铁形成不溶化合物。然而IP3、IP4微溶,并不完全沉淀。这就意味着铁沉淀法测得的值将IP5、IP4、IP3计入IP6,从而使结果偏高。另外这种方法灵敏度偏低,因此不能检测低浓度的IP6。2.2.2uv-c实验自从Harland和Oberleas在1977年介绍了一种阴离子交换色谱法梯度洗脱并定量分析IP6以后,许多学者又提出多种该方法的改良方法。其原理都是洗脱液消化后,测定无机磷,计算相应的IP6的含量。Harland和Oberleas的改良方法随后被定为美国公职分析化学家协会(AOAC)法。离子交换法简便易行,而且成本较低,因而常用来处理大量样品,虽然时间较长,但仍不失为一种好选择。植酸可以通过柱后反应形成可被紫外光(UV)、可见光或荧光监测仪检测的复合物。如磷酸根可以与Fe3+形成复合物而由UV法进行检测,这个原理可用来检测IP6及其它肌醇磷酸酯。根据磷酸根离子和Fe3+-甲基钙黄绿素蓝(MCB)之间的配位体交换,用柱后反应检测系统可以对IP3进行荧光检测。间接光度色谱法(IPC)克服了UV透光度的问题,其原理是用含有可吸光(通常是UV)离子的过洗液,取代了柱中样品的离子,从而在吸收基线上出现一个反向的波峰。但这种技术的灵敏度非常低。比色法测定IP6的原理是基于有色金属复合物遇到强螯合剂时其颜色的变化(变浅)。基于这个原理,氯化铁与磺基水杨酸反应生成一种粉红色的物质,在波长500nm处吸光度最强,当IP6存在时,铁与磷酸酯结合,故而不能与磺基水杨酸反应,结果导致粉红色消退,吸光度的下降与IP6的浓度成反比。我国的国家标准(GB/T17406-1998)测定方法就是根据这个原理而制定的。但这种方法中的铁同样可与低级肌醇磷酸酯发生反应。用离子交换法测得的IP6值低于铁沉淀法的结果。Ellis和Morris认为,是酸性提取物中的金属离子或蛋白质与植酸结合在一起,干扰了IP6,使结果偏低,如果向样品中加入乙二胺四乙酸(EDTA),将pH值调整至6,则两种方法的检测结果一致。此外,根据他们对使用的离子交换树脂颗粒大小及交叉联结对IP6复性的影响的研究,AG1-X4树脂(100~200目)为最合适的分离用树脂。但是低级肌醇磷酸酯及核苷对IP6的干扰在该方法中不可避免,资料显示用AOAC法测定IP6,其结果与用HPLC离子对色谱法测出的IP3、IP4、IP5、IP6的总和相关。此外,没食子酸、绿原酸对植酸的测定也有一定影响。这种方法的另一个不足之处是,也不能检测低浓度的IP6。2.2.3金属离子检测高效液相色谱(HPLC)法是以反相C-18为固相,磷酸二氢钾或乙酸钠为液态流动相,使IP6从多种醇中分离出来并进行定量。通常情况下,将样品中的植酸以HCl提取之后,用阴离子交换树脂进行纯化,然后进行HPLC分析。这种方法的优点是有效地浓缩了肌醇磷酸酯、去除了无机磷及大部分杂质,但同时也需通过蒸发去除提取液和洗脱液中的HCl,否则,虽然SAX柱在酸性条件下很稳定,但是大量氢离子和氯离子的存在仍会干扰定量检测结果。Bos等提出使用EDTA处理样品,使金属离子与EDTA紧密结合,消除了金属离子对植酸测定结果的干扰;该方法中,水杨酸、没食子酸、绿原酸、阿魏酸、枸橼酸、草酸对植酸的测定没有影响。该方法的不足之处在于IP6洗脱与溶剂峰的重叠,IP6极少在柱中滞留。而且其它含磷化合物也会被同时洗脱,导致结果偏高。另外,其它实验条件如pH值、离子强度、柱温及柱容积等也会对实验结果有一定影响。另外一种改良的HPLC法采用四丁基羟铵(TBA-OH)作离子对,因为它既是疏水的又是离子化的,从而能够将C-18传递给IP6,这种方法消除了由于溶剂同时洗脱而导致的缺陷。1986年,Sandberg和Ahderinne提出将植酸的粗提物在离子交换柱上提纯,用离子对HPLC法分离,并测定折射率,从而提高检测灵敏度。采用HPLC法可以将样品中IP6及其部分降解产物(IP3~IP5)分离并定量测量,同时离子对HPLC法也比较灵敏。但是这种方法不能区分肌醇磷酸酯的不同异构体,因为当运用折射率检测时,不能采用梯度洗脱法。此外,三磷酸腺苷也可与IP3同时被洗脱。2.2.4柱内离子注射法分离高效离子色谱法(HPIC)利用了电性相反的颗粒相互吸引的原理。其原理是分离时采用低容量、低亲和力的离子交换柱,与检测仪连接,洗脱液注入柱中,与柱中离子进行交换并在检测仪上形成一个持续的信号,当样品离子注入后,被树脂吸附并交换出等量的被洗脱的离子,样品中的离子因与树脂的亲和力不同而得到分离。该方法灵敏有效,能够同时测定多种离子。用离子色谱法同时结合梯度洗脱可以分离肌醇磷酸酯及其不同的异构体。这种方法可用来检测食物、肠内容物及酶的水解产物中的IP~IP6,灵敏度较强,并可在相当程度上区分异构体。2.2.5itp和传统缓冲系检测很早就有人采用毛细带电泳法(CZE)、毛细管等速电泳法(CITP)与传导性相结合的方法或间接UV吸光检测法检测植酸。等速电泳(ITP)通过在毛细管内将不同离子依其运动性不同的顺序,聚集成离散化的条带而达到分离离子成分的目的,是一种高效的分离离子成分的方法。在具有高运动活性的首离子和低运动活性的尾离子之间注入样品,当毛细管置于电场中时,离子运动的速度取决于它们的运动活性。Blatny等运用CITP及传导性检测的方法观察植酸水解产物与时间的关系,发现采用两种不同的缓冲系时,ITP是一种快速、简便的定量检测IP~IP6及正磷酸盐的方法。然而,毛细管电泳法的缺点是灵敏度相对较低,尚需改进浓缩技术及更灵敏的检测技术以使其成为更实用的检测植酸的方法。2.2.6外包法31p-nmr法31P-核磁共振(NMR)法可用来检测IP6及其降解产物,并可同时确定磷酸根的位置。因为IP6分子对称的C-2和C-5之间有一个平面。C-1和C-3位置上的P的信号可分辨,C-4和C-6也一样。因此,IP6以1∶2∶2∶1的比例产生4个共振峰。31P-NMR法在检测植物组织中的IP6及其立体形状,与其他成分如Cu2+、Zn2+等离子的连接状态时非常适用。pH值在2~7时植酸与金属离子形成立体的八面体,在pH值大于9时,植酸与金属离子形成四面体结构。由于IP6水解产物的存在,随着进一步降解,出现更多的异构体,而出现更多的信号。这种方法有一定的准确性及特异性,但设备昂贵,而且灵敏度较低,因此不能用来检测低浓度的肌醇磷酸酯。此外,组织中其他含磷化合物可能会干扰信号处理。2.2.7质谱-质谱法近年来,又有学者提出用高效薄层色谱法(HPTLC)检测植酸,在纤维素薄层板上以1-丙醇∶25%氨水∶水(5∶4∶1)展开,从而达到分离各级肌醇磷酸酯(IP~IP6)的目的。薄层色谱法简便灵敏,且成本较低,但分离能力较差,尚需排除其它核苷的干扰。March提出用气相色谱-质谱分析法(GC-MS)检测生物样品中的植酸。其原理是在六甲基二硅氮烷作为催化剂的条件下,肌醇与氯三甲