乳酸菌和酸性蛋白酶复合固态发酵对粕粗蛋白质、ph、理化性质及抗营养因子含量的影响

乳酸菌和酸性蛋白酶复合固态发酵对粕粗蛋白质、ph、理化性质及抗营养因子含量的影响

豆饼、豆饼和豆饼是一般的植物蛋白质饲料。不仅蛋白质含量高（豆饼42%46%；棉碗38%42%；油菜籽35%38%），氨基酸组成合理，包括各种矿物和微量元素，对动物饲料有重要影响。然而，这些脂肪饲料中含有的胰蛋白酶抑制剂、肿胀因素、硫醇锌、棉酚等抗营养因素限制了高脂肪饲料的使用。特别是，高含量的多囊卵巢和高口感的差异严重限制了不同饲料在食品工业中的使用（刘威海，2013；邓露芳等，2012；常磊，2012）。目前,化学处理、添加酶制剂和微生物处理是常用改善饲料品质的方法。但化学和酶制剂处理方法单一,效果欠佳,而微生物发酵具有反应温和、干物质损失少等优点,微生物发酵过程中除了能够消除抗营养因子外,还能将大分子蛋白质降解为多肽和小肽,甚至是游离氨基酸,同时发酵产物还含有丰富的益生素、有机酸等活性物质,从而改善蛋白质品质,提高养分利用率(李文立等,2013;姜丹,2011)。乳酸菌在发酵过程中产生乳酸、乙酸、丙酸和细菌素等多种物质,这些物质除具有杀毒抑菌作用外,还具有维持肠道内菌群平衡、抑制病原菌微生物生长、调节胃肠道功能等作用,同时饼粕类饲料经乳酸菌发酵后,有特殊的酸甜芳香气味,pH下降,能有效改善饲料的适口性。目前,大多数生物发酵饲料以单一或复合菌种发酵,但是以乳酸菌和酸性蛋白酶复合固态发酵的研究报道较少。因此,本试验以豆粕、棉籽粕和菜籽粕为原料,以乳酸菌为发酵菌种,同时添加酸性蛋白酶,研究固态发酵酶解对这3种粕类饲料粗蛋白质、pH、酸度及抗营养因子含量的影响,为合理利用粕类饲料资源及开发生物蛋白饲料提供科学依据。1材料和方法1.1培养基的制备豆粕(市售,粗蛋白质为41.49%);棉籽粕(市售,粗蛋白质为41.22%);菜籽粕(市售,粗蛋白质为40.12%)。乳酸菌为吉林省农业科学院畜牧分院动物营养研究所自主保藏。MRS固体培养基:蛋白胨10g、肉膏10g、酵母提取物5g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、K2HPO42g、MnSO4·4H2O0.25g、MgSO4·7H2O0.58g、葡萄糖20g、吐温-801mL、琼脂25g、H2O1L,调pH6.2~6.4,121℃灭菌20min。液体培养基:葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、K2HPO42g、H2O1L,pH7.0,121℃灭菌20min。1.2抑制剂和仪器酸性蛋白酶(50000U/g)购自黑龙江省肇东日成酶制剂有限公司;植酸标准品购自成都曼斯特生物有限公司;棉酚标准品购自中国药检所;棉籽糖标准品、水苏糖标准品、蔗糖、胰蛋白酶(1∶250)均购自Sigma公司;葡萄糖、二甲基甲酰胺均购自沈阳东兴试剂厂;单宁酸购自天津精细化工厂;间苯三酚、磺基水杨酸均购自天津市光复精细化工有限公司;偏矾酸铵购自北京化工厂;BAPNA、大豆胰蛋白酶抑制剂标准品均购自上海蓝季生物有限公司。SpecordS600型紫外可见分光光度计购自AnalyticJena公司;Konic高效液相色谱仪(配备SHE-DOX示差检测器)购自Konic公司;HZQ-C空气浴振荡器购自哈尔滨市东明医疗仪器厂。1.3发酵工艺的确定按照本实验室筛选优化的发酵条件(刘海燕,2013),将豆粕、棉籽粕和菜籽粕分别粉碎至40目,乳酸菌的接种量为3%,含水量调节至40%,同时添加0.5%酸性蛋白酶,自然pH,37℃密闭发酵72h。发酵期间,每隔12h取样1次(其中粗蛋白质测定每隔24h采样1次),于50~55℃烘干备测。1.4指标和方法的测量1.4.1发酵样品中粗蛋白质含量的测定发酵前和发酵后样品中粗蛋白质含量的测定采用微量凯氏定氮法(GB5511-85)进行。1.4.2u3000酸、碱分别滴定待测样品的体积取发酵前和发酵后样品各10g,加蒸馏水90mL,于摇床上100r/min振荡30min,测其pH。混合液过滤,取10mL滤液,加入2滴酚酞指示剂,用0.1mol/LNaOH标准液滴定至微红色,30s不褪色即为终点,记录消耗的NaOH体积。酸度(%以乳酸计)=C×V×K×10×100/10式中,C,标准NaOH溶液的浓度;V,滴定待测样消耗NaOH标准溶液的体积;K,乳酸的毫克当量。1.4.3测定项目及方法发酵样品中低聚糖含量参照宋志峰等(2009)方法进行测定;胰蛋白酶抑制剂含量其样品处理参照赵元等(2007)方法进行,活性参照Liu等(1989)方法进行测定;脲酶活性采用pH增值法进行测定;游离棉酚含量采用间苯三酚法进行测定;植酸含量采用FeCl3显色法进行测定;单宁含量采用矾显色法进行测定;异硫氰酸酯含量采用紫外法进行测定;唑烷硫酮含量采用比色法进行测定。1.5数据分析2结果与分析2.1蘑菇的固结酶分解对豆粗、白质、ph、ph和养分含量的影响2.1.1不同促进剂用量,分别考察不同由表1可知,豆粕经乳酸菌固态发酵酶解后,粗蛋白质含量从41.49%上升至42.81%、43.66%和45.40%,分别增加了3.18%、5.23%和9.42%;在发酵前期(0~24h)pH和酸度变化迅速,pH从6.63下降至4.34,酸度从0.60%增加至4.19%,此后,pH持续下降,而酸度持续升高,但变化较平缓,发酵至72h时,pH和酸度分别达到4.23和4.69%。2.1.2棉籽糖的降解由表2可知,乳酸菌固态发酵酶解对豆粕低聚糖(水苏糖和棉籽糖)含量影响较大,未发酵时水苏糖含量为5.21mg/g,发酵12h后降解至4.53mg/g,降解率为13.05%,此后随着发酵时间延长,水苏糖降解率均有不同程度增加,分别为37.62%、42.99%、53.36%、57.77%和61.42%;棉籽糖的降解情况与水苏糖相似,未发酵时棉籽糖含量为1.73mg/g,此后随发酵时间的延长,棉籽糖均有不同程度的降解,降解率分别为28.32%、36.99%、49.13%、52.02%、53.76%和56.65%;乳酸菌固态发酵酶解对豆粕胰蛋白酶抑制剂影响很大,发酵前豆粕的胰蛋白酶抑制剂活性为4550.94TIU/g,发酵12h后急剧下降至912.68TIU/g,下降近80%,此后胰蛋白酶抑制剂活性持续下降,至72h时仅为50.32TIU/g;未发酵豆粕中脲酶的活性较低,仅为0.05mgN/(g·min),发酵12h后脲酶活性为0;乳酸菌固态发酵酶解对豆粕植酸含量影响不明显,未发酵时豆粕中植酸含量为25.59mg/g,发酵72h时植酸含量为23.07mg/g,降解率仅为9.85%,说明乳酸菌对植酸的降解能力十分有限。2.2蘑菇的固结酶分解对棉碗白、ph、ph和养分含量的影响2.2.1发酵温度和粗蛋白质量由表3可知,乳酸菌固态发酵酶解对棉籽粕粗蛋白质含量影响明显,未发酵时棉籽粕粗蛋白质含量为41.22%,发酵24、48和72h时,粗蛋白质含量分别增加了3.66%、5.92%和7.76%;pH和酸度在发酵前期(0~24h)时分别迅速降低和升高,pH从5.98下降至4.83,酸度从0.60%增加至3.16%,随后持续降低和升高,但是变化趋势平缓。2.2.2乳酸菌固体发酵酶解对棉籽粕的降解作用由表4可知,乳酸菌固态发酵酶解不但没有降解游离棉酚,反而还有不同程度的增加,发酵前游离棉酚含量为0.49mg/g,发酵48h时为0.76mg/g,增加了55.10%,发酵72h时为0.89mg/g,增加了81.63%;同样,乳酸菌固态发酵酶解对棉籽粕中的植酸降解能力也十分有限,发酵24、48和72h时的植酸降解率分别为5.48%、14.34%和15.91%;但是,乳酸菌固态发酵酶解对单宁有较强的降解能力,并呈现出前期降解慢,而中后期降解快的趋势,发酵24h时单宁的降解率为19.75%,48h降解率为37.52%,72h时降解率可达62.30%。2.3蘑菇的固结酶分解对菜籽、粗蛋白质、ph、ph值和抗养分含量的影响2.3.1发酵温度对粗蛋白质的影响由表5可知,乳酸菌固态发酵酶解对菜籽粕粗蛋白质含量影响明显,发酵24、48和72h时,粗蛋白质含量分别增加了2.32%、6.33%和8.35%;pH和酸度呈现出与豆粕和棉籽粕相同的变化趋势,发酵前期变化迅速,后期趋于平缓。2.3.2发酵12h后异硫氰酸酯和唑烷硫酮的降解由表6可知,乳酸菌固态发酵酶解对菜籽粕中异硫氰酸酯和唑烷硫酮具有明显的降解作用,未发酵时异硫氰酸酯和唑烷硫酮分别为3.86和1.73mg/g,发酵12h后异硫氰酸酯和唑烷硫酮降解率分别为58.81%和28.90%,发酵48h时降解率分别为74.09%和58.96%,发酵72h后降解率分别为78.24%和88.44%;同样,乳酸菌固态发酵酶解对菜籽粕中植酸的降解能力也十分有限,发酵48和72h时,植酸的降解率分别为1.19%和5.39%。3讨论3.1豆浆营养品质变化植物蛋白的结构大都十分紧密,分子质量较大,不易消化吸收,吸收率往往也低于动物蛋白。乳酸菌在发酵过程中,需要利用底物中的营养物质来满足其维持需要和生长繁殖,底物中碳水化合物是乳酸菌生长繁殖能量的主要供应者,同时也为微生物蛋白质、脂肪和核酸等大分子物质的合成提供碳源,与此同时,在乳酸菌发酵过程中产生的酶类能够降解底物中纤维素、半纤维素、淀粉和果胶等大分子物质。因此,植物蛋白原料经微生物发酵后,其蛋白质绝对含量不变或略有下降,但由于碳水化合物的降解导致粗蛋白质相对含量的上升(孙宏,2013)。本试验中,豆粕经乳酸菌和酸性蛋白酶复合固态发酵后,发酵底物中粗蛋白质含量略有增加,这与尹惠君(2011)、胡永娜(2012)、胡瑞等(2013)研究结果一致。乳酸菌为化能异养型微生物,代谢活动以葡萄糖为碳源和能源,经发酵作用可将单糖转变为低分子的乳酸和其他有机酸,使得环境pH下降,酸度升高。本试验中豆粕经乳酸菌发酵酶解后,在前期(0~12h)pH和酸度变化迅速,此后分别持续下降和升高,但趋于稳定。刘可(2009)研究发现,乳酸菌在发酵酸豆乳过程中,酸度不断增加,发酵前期(0~6h)酸度增加明显,后期增加幅度趋于平缓;甘晶(2012)研究指出,乳酸菌发酵豆乳,发酵7h后菌种达到对数期,pH下降趋于稳定,这与本试验结果基本一致。豆粕虽然蛋白质含量较高,氨基酸配比合理,是公认理想的饲料蛋白来源,但也存在着胰蛋白酶抑制剂等多种抗营养因子,限制了对豆粕的使用。豆粕中的抗营养因子主要有胰蛋白酶抑制因子、凝集素、抗原蛋白、单宁、植酸、致甲状腺肿素、抗维生素因子、胀气因子、生物碱等。其中,含量较高,对豆粕营养效价、适口性及动物健康危害较大的有胀气因子、胰蛋白酶抑制因子、植酸和脲酶等。大豆低聚糖是可溶性寡糖的总称,其主要成分是水苏糖、棉籽糖和蔗糖等。棉籽糖是三糖,是半乳糖以α(1,6)糖苷键与蔗糖的葡萄糖基连接,而水苏糖是四糖,是棉籽糖的半乳糖以α(1,6)糖苷键与半乳糖连接。水苏糖和棉籽糖是半乳糖类的非还原性糖,由于动物小肠黏液中缺乏α-半乳糖苷酶,水苏糖和棉籽糖不被消化而直接进入大肠中,经肠道产气微生物利用,转化成挥发性脂肪酸,然后再产生气体,如CO2、H2、NH3,也可产生少量甲烷等气体,从而引起动物嗝气、肠鸣等肠胃胀气或腹疼现象。大豆低聚糖可以被α-半乳糖苷酶所降解,许多乳酸菌具有较强的α-半乳糖苷酶活性。本试验中,乳酸菌固态复合发酵具有较强的低聚糖降解能力,发酵48h时,水苏糖和棉籽糖的降解率分别达到53.36%和52.02%。蔡国林等(2008)研究指出,采用乳酸菌和酵母菌固态混合发酵豆粕,可使棉籽糖含量从1.2%降解至0.1%,水苏糖则被完全降解,这与本试验结果基本一致。胰蛋白酶抑制剂是一种分子质量为7975~21500u的多肽。胰蛋白酶抑制剂的主要危害是抑制人和动物分泌的胰蛋白酶活性。当人和动物食用了含有胰蛋白酶抑制剂的大豆制品后,一方面胰蛋白酶抑制剂阻碍肠道内蛋白水解酶的作用而使蛋白质消化率下降,从而引起恶心、呕吐等肠胃中毒症状;另一方面胰蛋白酶抑制剂还作用于胰腺本身,发生补偿性反应,造成机能亢进,刺激胰腺分泌过多的胰腺酶,导致胰腺分泌的内源性必需氨基酸缺乏,从而造成含硫氨基酸丰富的蛋白质内源代谢损失,动物出现消化吸收功能失调或紊乱,严重时出现腹泻,抑制了机体的生长。在本试验中,乳酸菌固态发酵酶解对豆粕胰蛋白酶抑制剂具有较强的降解能力,发酵12h时降解率达到80%。刘雪花(2011)利用乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌复合发酵豆粕,结果发现,胰蛋白酶抑制剂活性从2.687mg/g降至0.467mg/g,活性降低82.6%;李文立等(2013)采用枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌复合发酵豆粕,结果发现,随着发酵时间的延长,豆粕中胰蛋白酶抑制剂含量显著降低,这与本试验结果一致,说明乳酸菌发酵酶解能够有效降解胰蛋白酶抑制剂,主要是由于乳酸菌在发酵过程中产生的蛋白酶和复合添加的酸性蛋白酶可以将胰蛋白酶抑制剂水解成多肽,改变其结构和活性中心,并随着发酵酶解的进行而逐步水解。脲酶是大豆中能将尿素水解成NH3和CO2的酶。它本身没有毒性,但在适宜的水分、温度和pH条件下可被激活,将大豆中的部分含氮化合物分解成氨,降低蛋白氮、非蛋白氮的利用率,大量氨的存在会引起机体氨代谢障碍,导致人和动物体中毒。由于脲酶活性对温度十分敏感,在120℃时超过97.2%的脲酶就会失活。在本试验中,未发酵豆粕中脲酶活性仅为0.05mgN/(g·min),这可能与豆粕的生产工艺相关,发酵12h后脲酶活性为0。唐翔宇(2011)研究指出,未发酵豆粕的脲酶活性为0.201mgN/(g·min),用益生菌发酵后降解至0.01mgN/(g·min);刘雪花(2011)用混合菌株发酵豆粕,结果发现,脲酶活性由豆粕发酵前的0.473U/g降解至0.114U/g,降解率为75.81%,本试验结果与上述研究结果一致,充分说明微生物发酵能够有效降解脲酶。植酸是维生素B族的一种肌醇六磷酸酯,是植物性饲料中有机磷的主要存在形式,豆粕中60%~80%的磷酸以植酸形式存在。豆粕中的植酸含量可达2%左右,是一种很强的络合剂,能在肠胃中与带正电荷的金属阳离子形成难溶的植酸盐络合物,从而导致矿物质元素的利用率和生物学效价降低,严重者会影响机体正常代谢和生殖能力。此外,植酸还能与蛋白质或酶结合形成难溶的植酸—蛋白复合物,降低了蛋白质的吸收利用。在本试验中,所筛选的乳酸菌对植酸的降解能力十分有限,发酵72h时降解率仅为9.85%,这与Stale等(2005)研究结果一致,表明乳酸菌能够显著降低胰蛋白酶抑制剂的活性,但对植酸的降解作用不明显。目前,关于微生物发酵降解植酸的报道随着发酵菌种的不同,结果也不尽一致,唐翔宇(2011)利用纳豆芽孢杆菌发酵豆粕,结果发现48h后植酸的降解率为28.65%;姜丹(2011)研究指出,酵母对豆粕中植酸的降解能力要强于木霉;王婧瑶(2013)利用高蛋白酶降解菌通过紫外诱变的方式,可使豆粕中植酸的降解率达50%以上。微生物发酵对植酸的降解取决于发酵过程中产生植酸降解酶的活性,因此,不同菌种对植酸的降解不同,本试验中所筛选的乳酸菌对植酸的降解能力十分有限,需要进一步的改造优化。3.2复合固体发酵对游离棉酚的影响乳酸菌固态发酵酶解棉籽粕与豆粕一样,同样能够提高粗蛋白质的含量,降低pH,增加酸度。棉籽粕中含有的棉酚、单宁、植酸等抗营养因子,严重制约了棉籽粕在畜禽日粮中的使用。棉酚是一类多元酚类毒性物质,在棉籽粕中的含量为2.4%~4.8%。棉酚按其存在形式可分为结合棉酚和游离棉酚2大类。研究表明,动物摄入游离棉酚可直接产生急、慢性毒害反应,游离棉酚也可与棉籽蛋白中的赖氨酸结合,降低有效氨基酸的含量。世界卫生组织及FDA建议,食用棉籽蛋白制品中游离棉酚的含量不得超过400mg/kg,总棉酚含量不超过12000mg/kg,国家饲料卫生标准GB13078-2001明确规定,肉鸡、蛋鸡和育肥猪的配合饲料中游离棉酚含量的容许量分别不超过100、20和60mg/kg。本试验中,乳酸菌和酸性蛋白酶复合固态发酵不但没有降低棉籽粕中游离棉酚的含量,而且还有不同程度的增加,发酵48h时,游离棉酚增加55.10%,发酵72h时增加81.63%,这主要是由于乳酸菌发酵酶解过程中产生的蛋白酶或添加的酸性蛋白酶将结合棉酚降解为游离棉酚,从而使得游离棉酚含量增加。目前,国内关于棉酚的微生物降解结果也不一致。许多报道认为,微生物固态发酵对棉酚的脱毒率达70%以上(顾赛红等,2003;张文举等,2006),但也有不少研究结果认为,微生物发酵对游离棉酚没有作用。贾晓峰等(2009)研究指出,利用2株黑曲霉发酵棉籽粕不但没有脱毒作用,反而使游离棉酚的含量增加了7.79和6.3倍,假丝酵母对棉酚的脱毒率仅为5.96%~19.64%;常磊(2012)研究指出,利用3种芽孢杆菌和5种酵母处理棉籽粕,均不能有效去除游离棉酚;孙宏(2013)研究发现,利用芽孢杆菌和蛋白酶复合固态发酵对游离棉酚有负面影响。单宁又称鞣酸,是一类广泛存在于植物体内的多元酚类化合物,在棉籽粕中平均含量为3mg/g。单宁可以干扰蛋白质的利用,在畜禽体内可与消化道中的蛋白质和酶结合发生沉淀反应,形成溶解度极低的络合物,使饲料产生涩味影响其适口性,从而导致营养物质消化率下降。在本试验中,乳酸菌固态发酵酶解对单宁有较强的降解作用,但是发酵前期较慢而中后期快,发酵24h时降解率为19.75%,48h降解率为37.52%,72h降解率可达62.30%;同样,乳酸菌固态发酵酶解对棉籽粕植酸的降解能力也十分有限,发酵72h时降解率为15.91%。然而目前国内对微生物发酵棉籽粕的研究主要集中在对棉酚的降解,而对单宁、植酸的研究报道很少。国内关于微生物发酵对菜籽粕植酸降解的报道不一致,且大多采用复合菌种发酵,发酵效果受菌种、基质pH、温度和湿度等因素影响很大。孙林(2008)选用6%植物乳杆菌、4%蜡样芽胞杆菌和6%枯草芽孢杆菌,30℃发酵2d时,菜籽粕中植酸的降解率高达90.15%;陈娟等(2010)研究指出,白地霉、产朊假丝酵母、黑曲霉和热带假丝酵母复合发酵可使植酸降解率高达43.9%;胡永娜等(2012)研究发现,枯草芽孢杆菌、粪肠球菌和产朊假丝酵母混合发酵对植酸的降解率为19%。在本试验中,乳酸菌发酵对菜籽粕植酸的降解能力十分有限,发酵72h时降解率仅为5.39%,这与上述试验结果相比,降解率较低,其具体原因还有待进一步的研究。4乳酸菌固体发酵酶解对养鱼业的影响(1)乳酸菌和酸性蛋白酶复合固态发酵豆粕、