膜片钳灌流液配制,细胞培养液等试剂配制

膜片钳灌流液配制，细胞培养液等试剂配制表1细胞外灌流液成分 分子量mMg/LISO47%hypo47%hyperISO47%hypo47%hyperNaCl58.447070704.0914.0914.091MgCl2solution4.9M102pl102pl102plCaCl2solution1M2.02.02.02ml2ml2mlD-mannitol182.2140028025.51051.02HEPES238.31010102.3832.3832.383pH用Tris碱调至7.4在离子置换实验中，用同样毫摩尔浓度的NaI（分子量149.9,10.49g/L）、NaBr（分子量102.7,7.2g/L）和葡萄糖酸钠（分子量218.1，15.27g/L）替代灌流液中的NaCl。MgCl2和CaCl2中的Cl-含量很少，可以忽略不计。表2电极内液（pi]pettesolution）成分分子量mMg/100mlNMDG-Cl701.3663MgCl2solution4.9M1.224.5plHEPES238.3100.238EGTA38010.038D-mannitol182.21402.551Na2ATP2*首先将1.366gN-methyl-D-glucamine加入到80ml三蒸水中*用35.4%浓盐酸（约12滴）调溶液pH至8.0左右*再用1MHCl（约12滴）调溶液pH至4.5至5.5,加入HCl时必须缓慢小心，以防溶液pH下降过速。停止加HCl后pH仍会降低一点*加入除ATP以外的其他成分，三蒸水配制100ml，用3Mtris碱调溶液pH至7.25*过滤，分装，每支0.5ml*ATP用三蒸水配成100mM的储存液，过滤，分装，每支约12皿，放置于-20oC，使用前取10皿加入电极内液0.5ml中，使终浓度为2mM。表3humanperfusionmedium（HPM液）---（用途同PBS）成分分子量mMg/LNaCl58.441257.305KCl74.5550.373NaHCO384.01100.84HEPES238.3102.383Glucose198.1750.991Sucrose342.29206.85pH用NaOH调至7.40.22pm的微孔滤过膜除菌，分装无菌容器内，保存4oC，细胞培养用。4、【RPMI1640溶液】（配置前想看包装上的说明）1、 储存于4oC,用三蒸水配制（每袋/lL）2、 取约900ml三蒸水，倒入全部的1640粉，袋壁上的粉用三蒸水溶解，缓慢搅拌3、 加入2gNaHCO3（2g/L），缓慢溶解后取出磁力棒，加三蒸水定容至1L，再继续搅拌约1-2hrs4、 用1MNaOH或1NHCL调pH至7.1-7.2（因为过滤时会增高0.1-0.3）。溶液最终pH为7.45、 过滤、分装后保存-20oC6、 使用前配制成1640生长液，如配500ml含：1640液445ml+血清50ml+清链霉素5ml【小牛血清】胎牛血清（杭州四季青），使用前解冻后，36oC振荡灭活30mins，分装后保存在-20oC【冻存液】由60%1640液，30%胎牛血清，10%DMSO（二甲基亚飒）组成，使用前新鲜配制，4吃预冷30mins。【胰酶（trypsin）-EDTA溶液】胰酶-EDTA溶液（T-4049）含0.25%胰酶，0.02EDTA，用HPM（或PBS）配制而成，分装后保存于-20oC。用tris-base调pH至7.4。（EDTA：二乙胺四乙酸二钠）氯通道阻断剂【Adenosine5’-triphosphate（ATP）】ATP用于配制电极内液（A-5394）和灌流液（作为氯通道阻断剂，A-3377）及用于细胞增殖实验（A-5394）时用蒸馏水配制成100mM的储存液，调pH至7.25，然后储存于-20此，使用前用等渗或低渗灌流液稀释至10mM。用于细胞增殖实验时储存液过滤除菌。【tamoxifen】Tamoxifen（No.T-9262）溶液必须在实验当天新鲜配制。用甲醇配制成50mM储存液，室温保存，用前再用等渗或低渗灌流液稀释至20J1M。细胞培养时用10%1640液稀释，再过滤除菌。【5-nitro-2（3-phenylpropylamino）benzoicacid（NPPB）J5-硝基-2-（3-苯丙胺）苯甲酸NDDP（N-4779）在实验当天用DMSO配制成100mM的储存液，再用等渗或低渗灌流液稀释至100口M。细胞培养时用10%1640液稀释，再过滤除菌。【RNAseA】RNAseA（R6513）用PBS配制成50口g/ml的储存液，保存于-20oC。【PropidiumIodide（PI）］碘化丙啶（P4170）用蒸馏水配制成1mg/ml的储存液，4oC避光保存。【MTT】MTT（3,（4,5-dimethylthiazol-2-yl）2,5-diphenyltetrazoliumbromide）（M-5655）o用PBS制成浓度为5mg/ml的储存液，过滤，4oC避光保存。【Isopropanol】

纯异丙醇用36%HCL配制而成含0.1NHCL的盐酸异丙醇。各种离子的灌充液及离子源的配方项目离子灌充液离子源H+15mMNaCl+40mMKH2PO4（终浓度）pH=7.01ml0.01N（或0.1N）HCl+9ml0.1%LMPAgaroseCa2+100mMCaCl21ml1MCaCl2+9ml0.1%LMPAgaroseNa+250mMNaCl1ml1MNaCl+9ml0.1%LMPAgaroseK+100mMKCl1ml1MKCl+9ml0.1%LMPAgaroseCl-100mMKCl1ml1MCaCl2+9ml0.1%LMPAgaroseNH4+100mMNH4Cl1ml1MNH4Cl+9ml0.1%LMPAgaroseNO3+10mMKNO31ml1MKNO3+9ml0.1%LMPAgaroseCd2+100mMCdCl21ml1MCdCl2+9ml0.1%LMPAga