微生物的生长及控制课件

第七章微生物的生长及控制第七章微生物的生长及控制1生长(growth)：微生物在适宜的条件下，不断从周围环境中吸收营养物质转化为构成细胞物质的组分和结构，使个体细胞质量增加和体积增加，称为生长。繁殖(reproduction)：细胞个体数目的增加称为繁殖。

个体和群体的关系：

个体生长个体繁殖群体生长群体生长=个体生长+个体繁殖生长(growth)：微生物在适宜的条件下，不断从周围环境中2微生物生长的测定

细菌的群体生长繁殖

微生物生长繁殖的控制

微生物生长的概念（与动植物生长概念的差别）微生物生长的常规测定方法（原理和操作）

细菌生长繁殖的规律（标准生长曲线）及控制技术（连续培养的概念与方法）

微生物生长的测定细菌的群体生长繁殖微生物生长繁殖的控制3（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定（三）以生物量为指标测定微生物的生长（一）微生物生长概述第一节微生物生长的测定（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定（三）以生物量为指标4第一节微生物生长的测定

以数量变化对微生物生长情况进行测定1、培养平板计数法2、膜过滤培养法3、显微镜直接计数法

以生物量为指标测定微生物的生长1、比浊法2、重量法3、生理指标法在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长。第一节微生物生长的测定以数量变化对微生物生长情况进行51、平板菌落计数法

最常用的一种方法。常用来测定牛奶、食品、水及其它材料中的含菌数。有些细菌如无法在固体培养基中生长或其他原因，可用液体稀释法，借助统计学来判断其活菌数。通过查MPN(MostProbableNumber)来测知样品中活菌的可能数目。

以数量变化对微生物生长情况进行测定1、平板菌落计数法以数量变化对微生物生长情况进行测定6微生物的生长及控制课件7稀释倒平板法涂布平板法操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！稀释倒平板法涂布平板法操作较麻烦，对使用较多的常规8采用培养平板计数法要求操作熟练、准确，否则难以得到正确的结果：样品充分混匀；每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；同一稀释度三个以上重复,取平均值；每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；采用培养平板计数法要求操作熟练样品充分混匀；每支移液管及涂布92、膜过滤培养法2、膜过滤培养法10菌数低的样品（如水）→膜过滤→培养→菌落计数水中的细菌总数：124个/100ml如何对菌数低的样品，如水，中的细菌数量进行统计？菌数低的样品（如水）→膜过滤→培养→菌落计数水中的11（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定3、显微镜直接计数法采用细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数（计算一定容积里样品中微生物的数量）。缺点？不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；1）常规方法：（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定3、显微镜直接计数法12比浊法

以生物量为指标测定微生物的生长比浊法以生物量为指标测定微生物的生长13重量法将单位体积培养液中的菌体，用清水洗净，然后放入干燥器内加热或减压干燥，最后测定其干重。一般来说，干重约为湿重的10~20%，即1mg干菌=5~10mg湿菌=4~5×109个菌体。氮量法(生理指标法)

微生物细胞的含氮量一般比较稳定，所以常作为生长量的指标。如细菌含氮量约为菌体干重的14%。含氮量乘以6.25即可粗测出其蛋白质含量。其他法另外还有测定耗氧量或其它代谢产物。重量法14微生物的生长规律

一、细菌的个体生长和同步生长1、研究微生物生长变化规律的方法：（1）用电子显微镜观察细菌细胞的超薄切片；（2）采用同步培养技术，观察群体生长变化来研究个体的生长变化。2、同步生长：在培养物中的所有细菌，都处于同样细胞生长和分裂周期中生理状态。3、获得同步生长的方法：（1）诱导法：通过环境条件（2）选择法：通过选择性过滤和梯度离心微生物的生长规律

一、细菌的个体生长和同步生长154、同步培养

设法使群体中的所有细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期，这种培养方法称为同步培养。利用同步培养技术而使细胞群体处于分裂步调一致的状态，称为同步生长。同步培养方法有两种：选择法和诱导法。（1）选择法

主要有过滤法、区带密度梯度离心法和膜洗脱法。4、同步培养16微生物的生长及控制课件17（2）诱导法

化学诱导法利用停止或限制供给微生物细胞分裂所必需的某种养料，使所有的细胞都处于临分裂状态（但不分裂），然后在某一时刻供给细胞分裂所必需的养分，就能诱导出同步细胞群体。

物理诱导法是利用某些物理因子，使处于即将分裂的细胞的代谢活动受到抑制，从而使细胞在分裂阶段前停止，以求得以后分裂的同步。

（2）诱导法18细菌生长繁殖的规律（标准生长曲线）及控制技术（连续培养的概念与方法）

第二节细菌的群体生长繁殖细菌生长繁殖的规律（标准生长曲线）第二节细菌的群体生长繁殖19第二节细菌的群体生长繁殖一、生长曲线一条典型的生长曲线至少可以分为

迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期第二节细菌的群体生长繁殖一、生长曲线一条典型的生长曲线至少20典型生长曲线：

将少量单细胞微生物纯培养菌种接种到新鲜的液体培养基中，在最适条件下培养，在培养过程中定时测定菌体的数量，再以几何曲线表示，以菌数的对数为纵坐标，时间为横坐标，所绘成的曲线称为典型生长曲线。典型生长曲线：211、延滞期（或称延迟期、滞留适应期）（lagphase)

指少量微生物接种到新培养基中，在开始培养的一段时间内细胞数目不增加的时期。（1）特点：①群体生长速度近于零；②细胞重量增加，体积增大，但不分裂繁殖；③细胞内的RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性；④代谢活动特别是合成代谢旺盛；⑤对外界不利条件反应敏感。（2）原因：合成新的代谢酶类，适应新环境。（3）影响延迟期长短的因素：菌种、接种龄、接种量、培养基成分。1、延滞期（或称延迟期、滞留适应期）（lagphase)222、指数期（又称对数生长期）（logphase)：紧接延滞期的细胞数以几何级数增长的时期。

（1）特点：①菌数以几何级数增加；生长速率常数最大，代时最短而且稳定；②个体形态、化学组成、生理特性均较为一致；③酶系活跃，代谢旺盛。

（2）影响指数期微生物增代时间的因素：菌种、营养成分、营养物浓度、培养温度等。对数生长期的微生物其个体形态，化学组成和生理特性等均较一致，代时稳定，代谢旺盛，生长迅速，是研究基本代谢的良好材料，也是发酵生产的良好种子。2、指数期（又称对数生长期）（logphase)：紧接延23微生物的生长及控制课件243、稳定期(stationaryphase)

又称最高生长期，此时期微生物群体中新繁殖的细胞数目与死亡的细胞数目基本上处于平衡稳定的状态。

（1）特点：生长速率等于0；菌体产量达到最高点。

（2）稳定期到来的原因：①营养物尤其是生长限制因子的耗尽；②营养物的比例失调；③有害代谢产物的累积；④pH、氧化还原电位等物化条件越来越不适宜等。3、稳定期(stationaryphase)254、衰亡期(declinephase)

（1）特点：细胞生活力衰退，死亡率增加，细菌总数急剧下降。细胞出现多形态；有的微生物出现自溶现象；有的会进一步合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢物；芽孢杆菌在这一时期会产生芽孢；等等。

（2）原因：外界环境对继续生长越来越不利，引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。4、衰亡期(declinephase)26三、连续培养第二节细菌的群体生长繁殖将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。分批培养（batchculture）or封闭培养（closedculture）培养基一次加入，不予补充，不再更换。连续培养(Continousculture）在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。生长：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期1、连续培养(continuousculture)，又称开放培养

在一恒定的培养容器的流动系统中，以一定的流动速度不断补充入新的营养物质，同时以相同的速度排出培养物（包括菌体及代谢产物），使流动系统内的流量，细胞数量和营养状态维持恒定，使培养的微生物处于对数生长期的时间继续延长下去，这种方法称为连续培养。三、连续培养第二节细菌的群体生长繁殖将微生物置于一定容积的27第二节细菌的群体生长繁殖三、连续培养控制连续培养的方法恒浊连续培养不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定恒化连续培养保持恒定的流速第二节细菌的群体生长繁殖三、连续培养控制连续培养的方法恒浊28第二节细菌的群体生长繁殖三、连续培养（一）恒浊连续培养一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业（连续发酵）连续发酵与单批发酵相比的优点：

缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定；缺点：杂菌污染和菌种退化第二节细菌的群体生长繁殖三、连续培养（一）恒浊连续培养一般29第二节细菌的群体生长繁殖三、连续培养二）恒化连续培养使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。第二节细菌的群体生长繁殖三、连续培养二）恒化连续培养使培养30第二节细菌的群体生长繁殖三、连续培养通过控制流速可以得到生长速率不同但密度基本恒定的培养物多用于科研遗传学：突变株分离；生理学：不同条件下的代谢变化；生态学：模拟自然营养条件建立实验模型；第二节细菌的群体生长繁殖三、连续培养通过控制流速可以得到生313、连续发酵优缺点优点：①高效；②可实现自动化控制；③产品质量稳定；缺点：①菌种易退化②易染菌③营养物利用率低，产量常数小。3、连续发酵优缺点32微生物的高密度培养1、高密度培养（highcell-densityculture,HCDC)：指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养的10倍以上。2、应用：基因工程菌生产多肽类药物。3、高密度培养时应注意的问题：选取最佳培养基成分和含量；补料；提高溶解氧浓度；防止有害代谢产物生成。微生物的高密度培养1、高密度培养（highcell-den33第三节影响微生物生长的因素一、温度

从微生物界整体来看，微生物可以在-10~100℃范围内生长。但就具体的某种微生物来讲，它只能在一定的温度范围内生长。在这一定的温度范围内，每种微生物都有自己的生长温度三基点：最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度。在生长温度三基点内，微生物都能生长，但生长速率不一样。温度对微生物的生长具有双重影响。一方面，在一定的温度范围内，随着温度的上升，代谢活动逐渐旺盛，生长速度加快；另一方面，随着温度的上升，细胞内物质如蛋白质、酶、核酸等对温度比较敏感，逐渐变性失活。所以微生物处于它自己的生长温度三基点之外是极为不利的。

第三节影响微生物生长的因素一、温度34微生物的生长及控制课件35

值得注意的是，微生物的最适生长温度，是指它生长速度最快时的温度，但并不等于它能大量累积代谢产物时的温度。有的可能一样，有的不一样。因此只有通过试验，才能掌握什么样的生理活动需要多少温度才算适宜。例如生产味精的菌种A.S.1299，它的最适生长温度是30-32℃，而累积谷氨酸的温度以34-36℃为宜。值得注意的是，微生物的最适生长温度，是指它生36微生物生长的温度类型最低生长温度：生长繁殖的温度下限；最适生长温度：生长繁殖速率最快，但不一定是一切代谢活动的最适温度，不等于最适发酵温度，也不等于积累某一代谢产物的最适温度，例如：乳酸链球菌：25－30度,细胞产量最高；30度，乳酸产量最多；34度，Ｒ最高；40度，发酵速率最大。最高生长温度：微生物生长繁殖的上限，在此条件下，细胞容易衰老死亡。与胞内酶活性有关。致死温度：在10分钟内，杀死全部供试微生物的温度下限。基质：生理盐水；浓度：每毫升108个细胞。指导意义：①变温控制；②③消毒、灭菌的标准。微生物生长的温度类型最低生长温度：生长繁殖的温度下限；37微生物类型生长温度范围（℃）分布最低最适最高低温型专性嗜冷－１２５～１５１５～２０两极兼性嗜冷－５～０１０～２０２５～３０深海、冷藏中温型室温型１０～２０２０～３５４０～４５腐生菌体温型３５～４０寄生菌高温型

２５～４５５０～６０７０～９５温泉、堆肥

按生长温度范围分类

微生物类型生长温度范围（℃）分布最低最适最高低温型专性嗜冷38耐热菌耐热的硫化叶菌耐辐射奇球菌耐热菌耐热的硫化叶菌耐辐射奇球菌39

低温生长机制：①酶的最适温度低；②细胞膜中不饱和脂肪酸含量高低温杀(抑)菌机制：水冰晶损伤膜系统细胞质泄漏死亡

菌种保藏：加保护剂（防止冰晶过大，降低细胞脱水），杜绝反复冻融。

高温生长机制：①酶、蛋白质对热稳定；②细胞膜中饱和脂酸多。低温生长机制：①酶的最适温度低；②细胞膜中不40二、氧气按照微生物与氧的关系，可把微生物分成好氧菌和厌氧菌两大类，并可细分为五类。二、氧气41微生物的生长及控制课件42（1）专性好氧菌：必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶。绝大多数真菌和许多细菌都是专性好氧菌。（2）兼性好氧菌：

在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好；在有氧时靠呼吸产能，无氧时借发酵或无氧呼吸产能；细胞含SOD和过氧化氢酶。许多酵母菌和许多细菌都是兼性厌氧菌。（1）专性好氧菌：43（3）微好氧菌：

只能在较低的氧分压下才能正常生长的微生物。也通过呼吸链并以氧为最终受体而产能。（4）耐氧菌：

一类可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌，即它们的生长不需要氧，分子氧对它也无毒害。不具有呼吸链，仅依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。一般的乳酸菌多数是耐氧菌。微生物的生长及控制课件44（5）厌氧菌：

分子氧对它们都毒，即使短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在固体或半固体培养基深层才能生长；生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵等提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。（5）厌氧菌：45为什么氧气存在能够抑制甚至杀死厌氧菌？氧气进入菌体后，能接受电子而产生不同还原性的氧离子，如过氧离子、过氧化物自由基。过氧化物自由基和过氧离子都是很强的氧化剂，对微生物有毒，能氧化微生物过程中所必需的酶。好氧菌、兼性需氧菌以及微量需氧菌体内含有过氧化物歧化酶（SOD)和过氧化氢酶。这两种酶能将过氧化物自由基和过氧离子还原成没有毒性的水分子，所以它们不会被氧气所杀死。耐氧菌虽没有过氧化氢酶，但有过氧化物酶，能合成SOD，而不会被氧毒害。

厌氧菌体内都没有这些酶，所以不能忍受氧气。

为什么氧气存在能够抑制甚至杀死厌氧菌？46SOD学说：1971年McCord&Fridovich超氧化物阴离子自由基超氧化物歧化酶SOD学说：1971年McCord&Fridovich超47三、pHpH值对微生物的生长繁殖影响很大。从微生物界整体来看，pH值在5~9范围内，较易生长。各类微生物之间略有差异。和温度一样，对每种具体的微生物来讲，只能在一定的pH值范围内生长，也有自己的生长pH三基点：

最低pH值、最适pH值和最高pH值。（1）微生物生长繁殖的pH值大多数细菌、放线菌喜欢生活在中性偏碱的环境中，细菌最适的pH在7.0~8.0之间，放线菌的最适pH在7.5~8.5之间；而酵母菌和霉菌刚好相反，适合在偏酸的条件下生长，霉菌的最适pH值在4.0~5.8之间，酵母菌在3.8~6.0之间。三、pH48

（2）pH值对微生物生长的影响，主要表现在二个方面：能影响细胞膜的电荷，从而影响微生物对营养物质的吸收；能影响代谢过程中酶的活性，从而影响微生物的生命活动。

微生物在不同的生理阶段有不同的最适pH值，因此在发酵工业中，常通过控制pH值来达到预期的目的。如黑曲霉进行发酵，pH值在2~3时，发酵产物主要是柠檬酸，只有极少量的草酸；而当pH值接近中性时，则产生大量草酸。（2）pH值对微生物生长的影响，主要表现在49（3）微生物的生长对环境pH值的影响微生物在生长过程中，由于代谢作用，会产生酸性或碱性的代谢物，从而改变培养基或周围环境的pH值。为了避免pH值大幅度改变，而影响微生物生命活动的正常进行，通常采用添加缓冲剂或加入不溶解的碳酸盐的方法。在中性培养基内常加入磷酸盐缓冲剂；当培养物中产生大量酸时，可在配制培养基时加入不溶性的碳酸盐。（3）微生物的生长对环境pH值的影响50微生物的生长及控制课件51

第四节微生物的培养法第四节微生物的培养法52一、实验室培养法（一）固体培养1、好氧菌的培养：主要有试管斜面、培养皿平板及较大型的克氏扁瓶、茄子瓶等的平板培养方法。2、厌氧菌的培养1）高层琼脂柱2）Hungate滚管技术一、实验室培养法53微生物的生长及控制课件54微生物的生长及控制课件553）厌氧培养皿4）厌氧灌技术5）厌氧手套箱（二）液体培养1、好氧菌的培养2、厌氧菌的培养二、生产实践中微生物的培养（一）固体培养1、好氧菌的曲法培养2、厌氧菌的堆积培养（二）液体培养1、好氧菌的培养2、厌氧菌大规模的液体培养3）厌氧培养皿56第三节微生物生长繁殖的控制控制（有害）微生物的生长速率或消灭不需要的微生物，在实际应用中具有重要的意义。抑制(Inhibition)：生长停止，但不死亡；死亡(Death)：生长能力不可逆丧失；防腐(Antisepsis)：防止或抑制霉腐微生物在食品等物质上的生长；化疗(Chemotherapy)：杀死或抑制宿主体内的病原微生物；消毒(Disinfection)：杀死或灭活病原微生物（营养体细胞）；灭菌(Sterilization)：杀死包括芽孢在内的所有微生物；第三节微生物生长繁殖的控制控制（有害）微生物的生长速率或消57第三节微生物生长繁殖的控制一、控制微生物的化学物质化学物质的抗微生物能力的测定液体培养法最低抑制浓度（minimuminhibitoryconcentration

（MIC））实验平板培养法抑菌圈（zoneofinhibition）试验对杀菌或抑菌作用无法区分第三节微生物生长繁殖的控制一、控制微生物的化学物质化学物质58第三节微生物生长繁殖的控制一、控制微生物的化学物质能否通过实验进行区分？抗微生物剂抑菌：抑菌剂(Bacteriostaticagent)杀菌杀菌剂(Bactericide)溶菌剂(Bacteriolysis)待测化学物质对数生长培养物定时测定总菌数和活菌数第三节微生物生长繁殖的控制一、控制微生物的化学物质能否通过59第三节微生物生长繁殖的控制一、控制微生物的化学物质抗微生物剂非选择性（对所有细胞均有毒性）有选择性（对病原微生物毒性更强）消毒剂(Disinfectant)防腐剂(Antisepsis)抗代谢药物抗生素中草药有效成分（化学治疗剂）第三节微生物生长繁殖的控制一、控制微生物的化学物质抗微生物60第三节微生物生长繁殖的控制一、控制微生物的化学物质（二）抗代谢物

磺胺药物是最早发现，也是最常见的化学疗剂，抗菌谱广，能治疗多种传染性疾病。大多数革兰氏阳性细菌（如肺炎球菌、溶血性链球菌等）某些革兰氏阴性细菌（如痢疾杆菌、脑膜炎球菌、流感杆菌等）对放线菌也有一定的作用。1934年，德国I.G.Farben染料厂的G.Domagk一种红色染料（prontosil），白鼠静脉注射，可治疗因链球菌引起的感染，但在体外却无作用。1935年，进一步证明prontosil对人的链球菌病也有效。法国人Trefouel和英国人Fullerprontosil在体内转化成了具有抑菌作用的磺胺第三节微生物生长繁殖的控制一、控制微生物的化学物质（二61第三节微生物生长繁殖的控制一、控制微生物的化学物质（二）抗代谢物

磺胺是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物作用机理：磺胺的抑菌作用是因为很多细菌需要自己合成叶酸而生长。磺胺对人体细胞无毒性，因为人缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶----二氢叶酸合成酶，不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行合成叶酸，而必须直接利用叶酸为生长因子进行生长。第三节微生物生长繁殖的控制一、控制微生物的化学物质（二62第三节微生物生长繁殖的控制一、控制微生物的化学物质G.Domagk因发明第一种治疗微生物疾病的“神药”获得了1939年的诺贝尔生理和医学奖第三节微生物生长繁殖的控制一、控制微生物的化学物质G.63第三节微生物生长繁殖的控制一、控制微生物的化学物质（三）抗生素第三节微生物生长繁殖的控制一、控制微生物的化学物质（三64第三节微生物生长繁殖的控制二、控制微生物的物理因素杀灭或抑制微生物的物理因素温度辐射作用过滤渗透压干燥超声波等第三节微生物生长繁殖的控制二、控制微生物的物理因素杀灭或抑65二、高温杀菌

(以耐热芽孢的致死温度为参考)

（一）种类

1、干热灭菌法

灼烧法：明火杀菌＞800℃

烘箱热空气灭菌法（160－170℃，1－2小时）2、湿热灭菌法常压：①