结核分枝杆菌γ

结核分枝杆菌7»干扰素体外释放试验(TB-IGRA)对结核性胸腔积液的诊断价值【摘要】目的探讨结核分枝杆菌(MTB)Y-干扰素体外释放试验(TB-IGRA)在疑似MTB感染体胸腔积液患者快速诊断中的应用价值。方法疑似MTB感染伴胸腔积液患者138例，应用TB-IGRA定量检测外周血淋巴细胞分泌Y-干扰素的水平。利用MTBDNA法检测胸腔积液中的MTB，同时用免疫金标法检测血清MTB抗体，并进行统计学分析。结果138例疑似患者经过痰和胸腹水抗酸染色镜检，痰液和胸腹水MTB培养，结核菌素皮肤试验，MTBDNA和MTB抗体等试验确诊结核病患者48例，阳性检出率34.8%，TB-IGRA的阳性检出率为32.6%，MTBDNA的阳性检出率为13.8%，血清MTB抗体的阳性检出率为10.1%。对已确诊的48例结核病患者进行数据分析，TB-IGRA，MTBDNA和血清MTB抗体的准确率分别为93.8%，39.6%，29.1%。据统计分析可知，TB-IGRA的阳性检出率和准确率均显著高于其他2种方法(P<0.05)。TB-IGRA对疑似MTB感染的胸腔积液患者诊断的阳性预测值为93.3%，阴性预测值为93.6%。结论TB-IGRA对疑似MTB感染伴胸腔积液患者的诊断具有快速，高敏感性高特异性的优点，优于MTBDNA和血清MTB抗体试验，可以作一种新的技术用于人体MTB感染的诊断。【关键词】y-干扰素释放试验；结核分枝杆菌；DNA；抗体；胸腔积液EvaluationofthevalueofTB-IGRAtestinmycobacteriumtuberculosisinfectofpatientswithpleuraleffusion[AbstraetJobjectiveToinvestigatetheapplicationsignificanceofmycobacteriumtuberculosisIFN-rreleaseassay(TB-IGRA)intherapiddiagnosisforsuspectedMTBinfectedpatientswithpleuraleffusion.MethodsThe138patientswithpleuraleffusionwhichweresuspectedashavingsuspectedMTBinfectionwereenrolled.TB-IGRAwasusedtodeterminethelevelofIFN-rofperipheralbloodlymphocyte.TheMTBDNAmethodwastodetectMTBinpleuraleffusion,meanwhileserumanti-MTBantibobywasdetectedbyimmunogoldfiltrationassay,andtheresultswerediagnosedastuberculosisbysputum,pleuraleffusionandascitessmeartest,sputum,pleuraleffusionandascitesMTBculture,tuberculinskintest,MTBDNAmethodandanti-MTBantibodytest,andthepositiveratewas34.8%.ThepositivetypeofTB-IGRAinthe138patientswithpleuraleffusionwas32.6%,ThepositiverateofMTBDNAmethodwas13.8%,andthepositiverafeofanti-MTBantibodytestwas10.1%.Thedateof48patientswithtuberculosiswereanalyzed.TB-IGRAhadtheconsistencyrateof93.8%,whiletheconsistencyratesofMTBDNAmethodandanti-MTBantibodytestwere39.6%and29.1%respectively.ThepositiverateandconsistencyrateofTB-IGRAweresignificantlyhigherthanthoseoftheothers(p<0.05).ThepositiveandnegativepredictivevaluesofTB-TGRAinsuspectedMTBinfectedpatientswithpleuraleffusionwere93.3%and93.6%respectively.ConclusionsTB-IGRAisfast,hipersensitivityandhighspecificitytodiagnosethesuspectedMTBinfectedpatientswithpleuraleffusion.TB-IGRAisbetterthanMTBDNAmethodandanti-MTBantibodytest.TB-IGRAcanbecomeanewdiagnoticmethodtobeappliedinthediagnosisofMTBinfection.［keywords］interferon-gammareleaseassay(IGRA);Mycobacteriumtuberculosis(MTB);DNA;Antibody;pleuraleffusion结核病是世界上单一致病菌引起的死亡最多的疾病，据世界卫生组织统计，2011年全球约有870万例新发结核病患者，而死于此病的人数达140万［1］。结核性胸膜炎是一种仅次于淋巴结核的常见肺外结核病，临床表现为胸膜性疾病和干咳及单侧少至中等胸腔积液⑵。目前，结核性胸膜炎诊断准确性较低，结核胸腔积液中找结核分枝杆菌是目前确诊结核性胸膜炎的重要依据，但涂片阳性率极低，仅为0~25%，而胸腔积液的细菌培养阳性率低，且时间长，难以及时报告临床治疗，诊断金标准的胸膜活检阳性率仅为62.2%~69.7%［3,4］。但其为有创检查，患者依从性差，检查费用高，不符合常规应用。因此，寻找一种无创，快速和准确的胸腔积液诊断方法成为提高结核性胸膜炎诊断水平的关键。近年来，国外有关研究证实［5,6］，结核分枝杆菌相关Y-干扰素体外释放试验(tuberculosisinterferon-rreleaseassays)TB-IGRA对检测结核分枝杆菌的感染具有较好的特异度和敏感度。由于胸水中免疫反应的强度比血液中更高，因此，通过检测胸水中的Y—干扰素释放水平来诊断活动性胸膜结核被证实是有意义的。本研究通过对与结核感染相关性的胸腔积液进行TB-IGRA试验，MTBDNA和MTB抗体检测，探讨TB-IGRA在明确胸腔积液中结核诊断中应用价值。1材料和方法1.1研究对象选择2013年4月至2015年2月因患有胸腔积液而在惠山区人民医院相关科室住院的患者，入选标准：咳嗽，呼吸困难，急促，胸敞片和计算机断层扫描检查提示伴有中等量以上的胸腔积液的患者。排除标准;(1)入院前，实施抗结核治疗＞1星期者；(2)合并糖尿病以及其它严重的肝功能、肾功能异常或功能不全患者；(3)人类免疫缺陷病毒阳性者。根据上述标准共入选患者138例，其中男88例，女50例，中位年龄56.8(29-73)岁，均符合2008年8月1日宣布的中华人民共和国卫生部颁发的中华人民共和国卫生行业标准。1.2仪器和试剂MutiskanMKs型酶标仪购自赛默飞世尔(上海)仪器有限公司，北京万泰生物药业股份有限公司的分枝杆菌r-干扰素释放试验检测试剂盒(TB-IGRA试剂)，MTBDNA检测试剂盒由广东达安基因有限公司提供，PCR扩增仪与美国ABI公司Tn7300实时荧光定量PCR仪。上海奥普生物制药公司生产的MTB抗体胶体金法诊断试剂盒1.3方法1.3.1TB-IGRA试剂试验步骤BD肝素锂抗凝管采血等抽取＞5ml静脉血，马上轻柔颠倒混匀3次以上，把全血分装到3个不同的培养管中(T测试管，N本底对照管，P阳性对照管等)，等分装1ml，分装后轻柔颠倒培养管5次，于37°C培养管中静置培养22+-2h，培养完成后，留取收集上清液，然后用双抗体夹心法定量检测上清液中的IFN-r的含量，T管中有特异性开高的IFN-r的量，来测定为结核感染阳性。1.3.2MTBDNA检测，胸腔积液沉渣抽提MTBDNA，检测试剂盒由广东达安基因有限公司提供。联合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)扩增仪为美国MBI公司的7300实时荧光定量PCR仪，严格按标准操作程序进行。1.3.3血清MTB抗体检测检测所用试剂为上海奥普生物医药公司提供的MTB抗体胶体金法诊断试剂盒，实验原理为斑点免疫金渗滤法，严格按说明书操作。1.4统计学方法采用spss16.0软件进行统计分析，两种方法的阳性率比较采用X2检验，以p<0.05为差异具有统计学意义。2结果138例疑似MTB感染的胸腔积液患者TB-IGRA和MTBDNA检测阳性率和准确率比较138例疑似MTB感染的胸腔积液患者用TB-IGRA和MTBDNA检测，两者同时阳性13例，TB-IGRA阳性而MTBDNA阴性阴性32例，MTBDNA阳性而TB-IGRA阴性6例，TB-IGRA的阳性检出率为32.6%，MTBDNA的阳性检出率为13.8%，两种方法的阳性检出率比较，差异有统计学意义(X2=11.6,P<0.05)见表1表1138例疑似MTB感染的胸腔积液患者TB-IGRA和MTBDNA检测阳性率比较TB-IGRAMTBDNA合计阳性阴性阳性133245阴性68793合计1911913848例确诊MTB感染的胸腔积液患者用TB-IGRA和MTBDNA检测，两者同时阳性8例，TB-IGRA阳性而MTBDNA阴性34例，MTBDNA阳性而TB-IGRA阴性4例，TB-IGRA的准确率87.5%,MTBDNA的准确率为25%，两种方法的准确率比较，差异有统计学意义(X2=5.84，P<0.05)见表2表248例MTB确诊MTB感染用TB-IGRA和MTBDNA检测准确率比较TB-IGRAMTBDNA合计阳性阴性阳性83442阴性426合计123648138例疑似MTB感染的胸腔积液患者TB-IGRA和MTB抗体的阳性率，不准确度比较。138例疑似MTB感染的胸腔积液患者用TB-IGRA和MTB抗体检测，两者同时阳性9例，TB-IGRA阳性而MTB抗体阴性36例，MTB抗体阳性而TB-IGRA阴性5例，TB-IGRA的阳性检出率32.6%，MTB抗体阳性检出率10.1%,两种方法阳性检出率比较，差异有统计学意义(X2=21.2，P<0.05)见表3表3138例疑似MTB感染的胸腔积液患者TB-IGRA和MTB抗体阳性率比较

阳性阴性阳性93645阴性58893合计14124138TB-IGRAMTB抗体合计48例确诊MTB感染的胸腔积液患者用TB-IGRA和MTB抗体检测，两者同时阳性6例，TB-IGRA阳性而MTB抗体阴性3例，MTB抗体阳性而TB-IGRA阴性3例，TB-IGRA的准确率为87.5%，MTB抗体的准确率为18.75%，两种方法的准确率比较，差异有统计学意义（X2=4.827，P<0.05），见表4表448例确诊MTB感染的胸腔积液TB-IGRA和MTB抗体检测的准确率比较TB-IGRAMTB抗体合计阳性阴性阳性63642阴性336合计93948138例疑似MTB感染的胸腔积液患者TB-IGRA,MTBDNA,MTB抗体检测结果比较计算TB-IGRA,MTBDNA,MTB-Ab的敏感性，特异性，阳性预测值以及阴性预测值，可以看出TB-IGRA对诊断结核性胸腔积液敏感性，特异性，阳性预测值，阴性预测值最高。见表5表5138例疑似MTB感染的胸腔积液患者TB-IGRA，MTBDNA,MTB抗体检测结果比较检测方法阳性阴性敏感性％特异性％阳性预测值％阴性预测值％TB-IGRA459387.5(42/48)96.7(8於0)93.3(4跑5)93.6(8於3)MTBDNA1911925.0(1跑8)93.3(84/90)63.2(12/19)70.6(84/119)MTB抗体1412418.8(9/48)95.6(86/90)64.3(9/14)69.4(86/124)3讨论结核病是一种常见且难以进行病原学诊断的疾病，近年来发病率呈逐年上升趋势，严重危害人体健康，结核病的实验室诊断是发现传染源的主要途径和手段，是确定结核病诊断的治疗方案和重要依据，也是考核疗效评价效果的重要参考。虽然目前诊断结核病的方法较多，如结核菌素纯蛋白衍生物（PPO）皮试，血清结核抗体（TB-Ab），胸腔积液TB-DNA等，但每种检测方法的灵敏度和特异度均不太理想，尽管从结核性胸腔积液中培养出结核分枝杆菌是金标准，虽可提高诊断率，但耗时较长（一般需培养6-8周），作为早期诊断的意义不大。现临床上常用诊断结核性疾病的方法有PPD皮试和血清结核抗体（TB-Ab）检测，PPD作为结核感染应用最普遍的筛查工具，存在假阳性高，特异性低的局限性⑺。PPD在免疫力低下的人群中，其灵敏度下降【8.9］°MTB感染后机体主要的免疫反应为T细胞免疫，其血清抗体检测意义也不大［10］。近年来，PCR荧光探针检测结核分枝杆菌DNA（TB-DNA）也应用于结核性疾病的诊断，其具有较好的灵敏度及特异性。Trajman等口】研究报道指出，胸腔积液TB-DNA在结核性胸膜炎中诊断敏感性为35%~82%，特异性为85.4%~100%，Smach等[12]报道TB-DNA诊断敏感性为24%~60%，特异性为80%~100%，本文胸腔积液TB-DNA诊断结核性胸膜炎的敏感性为25.0%特异性为93.3%，与以上报道大致相符。随着科技发展，近年来发展起来的以T细胞免疫应答为基础的IFN-r释放试验(interferongammareleaseassays,IGRA)被广泛应用于欧美国家的各级医疗机构列入结核病诊疗指南，TB-IGRA作为一项新的诊断技术[13]，主要用于检测结核菌潜伏感染，此外该实验还被用于活动性肺结核的诊断，预测和鉴别诊断。本文阐明了IGRA检测胸水中的T细胞反应以检测结核分枝杆菌感染的试验取得了较好的效果。IGRA采用两种结核特异性蛋白：早期分泌抗原靶蛋白(earlysecretingantigenictarget,ESAT-6)和培养滤出蛋白(culturefiltrateprotein,CFP10)，刺激夕卜周血中特异性T淋巴细胞分泌IFN-r,于37°C体外培养20-23h后，通过双抗体夹心法定量检测培养液中IFN-r的含量，以反映体内结核特异性Th细胞的水平，这个显著的优异性使得r-干扰素释放试验得以应用于临床。本文研究表明TB-IGRA对结核性胸腔积液的诊断具有较高特异性和敏感性，分别为96.7%和87.5%，与国外报道符合【14]同时将TB-IGRA与TB-DNA;TB-Ab进行比较，其阳性率分别为93.8%，39.6%和29.1%，可见，TB-IGRA检测阳性率明显高于其他方法，可以肯定TB-IGRA对诊断结核性胸腔积液是较为敏感的项目。综上所述，TB-IGRA作为体外实验，所用抗体特异性高，且不受卡介苗等其他致病性非结核分枝杆菌的干扰，具有检测安全方便，快速等优点，可作为结核分枝杆菌感染的常规诊断方法，在结核病的临床诊断中具有良好的应用价值，但三者联合检测能提高对结核的准确诊断。参考文献【1】GlaziouP,FalzonD,FloydK,etal.Globalepidemiologyoftuberculosis[J].SeminRespirCritCareMed,2013,34(1):3-16.【2】杨仪，李向炯，翁家豪.不同年龄组结核性胸膜炎的临床特征[J].中华全科医学，2013,11(8)：1235-1236.【3】SakuraraM,MasudaK,HebisawaA,etal.Thoracoscopicpleuralbiopsyfortuberculouspleurisyunderlocalanesthesia[J].AnnThoracCardiovaseSurg,2006,12(4):245-248.【4】GopiA,MadhavenSM,ShannaSK,etal.Diagnosisandtreatmentoftuberculouspleuraleffusionin2006[J].Chest,2007,31(3):880-889.【5】DielR,LoddenkempeirR,NienhausA.Evidence-basedcomparisonofcommercialinterferon-rreleaseassaysfordetecingactiveTB:ametaanalysis[J].Chest,2010,137(4):952-968.【6】DielR,LoddenkemperR,Meywald-WalterK,etal.PredictivevalueofawholebloodIFN-gammaassayforthedevelopmentofactivetuberculosisdiseaseafterrecentinfectionwithMycobacteriumtuberculosis[J].AmJRespirCritCareMed,2008,177(10):1164-1170.【7】张立华，靳文香，贾红彦，等。T-SPOT与结核菌素试验对结核病患者的临床诊断价值[J].中华临床医师杂志：电子版，2012,6(14)：4107-4108.【8】OzekinciT,OzbekE,CelikY.ComparisonoftuberculinskintestandaspecificT-cellbasedtest,T-Spot.TBforthediagnosisoflatenttuberculosisinfection[J].JIntMedRes,2007,35(5):696-703.【9】KimSH,SongKH,C