婴幼儿配方奶粉中氨基酸的测定

婴幼儿配方奶粉中氨基酸的测定

蛋白质是发育过程中必要的有机成分，氨基酸是身体蛋白质的基本单位。牛奶中的氨基酸主要有18种,包括苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、蛋氨酸(Met)、色氨酸(Trp)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、酪氨酸(Tyr)、脯氨酸(Pro)、胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg),其中前9种为婴幼儿必需氨基酸。理论上,食品中必需氨基酸的含量和比例越接近人体必须氨基酸模式,其组成的蛋白质质量越高。2010年3月底国家卫生部颁布了新的婴幼儿配方食品安全国家标准,在其附录A中列出了推荐的婴幼儿配方食品中必需与半必需氨基酸的含量,这对于婴幼儿配方奶粉的生产和研发起到了一定的指导和规范作用。应用于氨基酸分析的方法很多,包括柱后衍生高效阳离子交换色谱法、柱前衍生反相高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法等。其中柱后衍生高效阳离子交换色谱法被认为是氨基酸分析的经典方法,早在上世纪60年代初,运用该法研制的氨基酸分析仪便已问世,如今的氨基酸自动分析仪早已实现了程序控制自动化和数据处理电脑化。本研究先用盐酸将婴幼儿配方奶粉中的蛋白质水解为游离氨基酸,再通过氨基酸自动分析仪对其中的16种氨基酸(Trp和Cys除外)进行测定,对结果的线性、重复性、回收率以及室温下待测液的稳定性进行了一番分析,为今后产品中各氨基酸含量的控制提供了检测依据。1材料和方法1.1实验设备AL204电子分析天平梅特勒-托利多仪器有限公司;DHG-9240A电热恒温干燥箱、DZF-6050真空干燥箱上海精宏实验设备有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循环水多用真空泵巩义市予华仪器有限公司;L-8900氨基酸自动分析仪日本日立。1.2烧管、水解、烘干称取混合均匀的婴幼儿配方奶粉0.1g(精确至0.0001g)置于水解管中,加入10～15mL6mol/L的盐酸。接上真空泵抽真空10min至接近0Pa,在抽真空状态下用酒精喷灯烧管封口。并将封口严密的水解管放在(110±1)℃的恒温干燥箱内水解22h后,取出冷却。打开水解管,将水解液全部转入25mL容量瓶中,用去离子水定容至刻度。取滤液1mL置于25mL小烧杯中,在40～50℃的真空干燥箱中烘干(如有残留物,用1～2mL去离子水溶解,再干燥)。加入5mL0.02mol/L的盐酸溶液溶解,经0.22μm的滤膜过滤,作为待测液。1.3定量分析按仪器说明书上机操作,用外标法定量,进样量20μL。2结果与分析2.1盐酸水解蛋白质图1和图2分别为氨基酸液体混标及婴幼儿配方奶粉中分离出的各种氨基酸,图中VIS2(440nm)用于检测Pro,VIS1(570nm)用于检测除Pro外的其他氨基酸。由于Trp在盐酸水解蛋白质的过程中易被分解,Cys也容易在此过程中部分被破坏,故在本文中对以上两种氨基酸暂不予以讨论。在图1中,将原装氨基酸液体混标稀释25倍后直接上机,可使其中的十七种氨基酸(包括Cys)在30min内得到十分理想的分离效果。在图2中,婴幼儿配方奶粉经盐酸水解后,其待测液中几乎没有杂质吸收峰,且各氨基酸的峰形都很好。比较图1及图2的出峰时间和峰形可发现,经该法处理后的婴幼儿配方奶粉样品上机后可以得到同氨基酸液体混标直接稀释上机相当的分离效果。2.2氨基酸标准曲线的绘制用0.1mol/L的HCl将原装氨基酸混标液分别稀释成浓度为12.5、25、50、100、150、200、250μmol/L的溶液,上机进样测定,得到相应的峰面积,以标样质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,分别绘制出16种氨基酸的标准曲线,从而获得相应的回归方程和线性相关系数,结果见表1。结果表明,用氨基酸自动分析仪测得的16种氨基酸标准曲线在12.5～250μmol/L的范围内均呈现良好的线性关系,相关系数R2均在0.999以上。2.3重复性测定结果对同一婴幼儿配方奶粉中的十六种氨基酸同时进行六次重复测定,以评价该方法的重复性,结果见表2。通过表2的统计分析表明,应用该法测得婴幼儿配方奶粉中的十六种氨基酸重复性都非常理想,其变异系数RSD均在2.0%以内。2.4酸固体单标稀释液的配制在已知各氨基酸含量的奶粉中分别添加三个浓度梯度的16种氨基酸固体单标稀释液,每个浓度梯度均做双样,按上述方法处理后,测出结果见表3。由表3可知,用该方法测得的奶粉中16种氨基酸三个浓度梯度的平均回收率在95.0%～105.1%之间。2.5不同密度下met的平均损失量由于本公司所购买的L-8900高速氨基酸分析仪样品室没有附带冷冻模块,为验证试样处理后所得的待测液能否在实验室常温下(20～28℃)放置,特对其进行稳定性分析:按上述方法(盐酸水解)将奶粉处理成待测液后,分别于0、5、20h后进行上机分析,每组做5个平行实验。计算出平均损失量和平均损失率,所得结果见图3～图6。从图3、图4可以看出,待测液常温放置5h后各氨基酸的平均损失量都比较低,均在±0.01nmol/20μL以内。平均损失率除Met外均在1%以下,Met的平均损失率也在6%以下(国标允许检测相对偏差12%)。从图5、图6可以看出,待测液常温放置20h后各氨基酸的平均损失量比放置5h的波动范围大些,但仍比较低,在(-0.01～+0.02)nmol/20μL之间。平均损失率除Met外依然都在1%以下,而Met的平均损失率则在30%以下。对于结果中Met平均损失率偏高的原因,可能是由于其本身含量较低,检测误差造成的,因为从图3和图5可以看出,Met的实际平均损失量并不大。从图3～图6可以分析出,各样品待测液在常温放置0、5、20h后所检出的氨基酸总量没有明显差别。因此,只要实验室内温度控制得当,短时间的放置并不会对待测液所检出的结果产生太大影响。3回收率及稳定性3.1通过盐酸水解、氨基酸自动分析仪测定法能使奶粉中的十六种氨基酸(Thr、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Lys、Gly、Ser、Ala、Asp、Glu、Tyr、His、Pro、Arg)得到十分理想的分离效果。线性实验表明,该法在12.5～250μmol/L的范围内均呈现良好的线性关系,重复性实验的变异系数均在2.0%以内,在回收率实验中,三种不同浓度梯度的平均回收率也均在95.0%～105.1%之间。3.2通过对待测液进行的稳定性分析表明,常温放置5h后,除Met外的其余15种氨基酸的平均损失率均在1%以内,Met的平均损失率也在6%以内(国标允许检测相对偏差12%);常温放置20h后,除Met的平均损失率上升到了30%左右外,其余15种氨基酸的平均损失率还是控制在了1%以内。鉴于常温放置5h及20h后Met的实际平均损失量并不高(分别在0.005nmol/20μL和0.020nmol/20μL以内),因此在实际操作中,只要实验室内温度控制得当(20～28℃),短时间内将待测液放置在样品盘中并不会对检测结果产生太大影响;同时建议每隔5～6个样再重进一针标样进行校正,以确保结果的准确性。婴幼儿配方奶粉市售