盐胁迫对黄瓜幼苗根系脯氨酸和多胺代谢的影响(完整版)实用资料

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盐胁迫对黄瓜幼苗根系脯氨酸和多胺代谢的影响1盐胁迫对黄瓜幼苗根系脯氨酸和多胺代谢的影响（完整版）实用资料(可以直接使用，可编辑完整版实用资料，欢迎下载）段九菊,郭世荣*,樊怀福,王素平,康云艳南京农业大学园艺学院,南京(210095摘要:采用营养液栽培,研究了盐胁迫对抗盐能力不同的两个黄瓜品种幼苗根系脯氨酸(Pro和多胺(PAs代谢的影响。结果表明,盐胁迫通过提高吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS活性,抑制脯氨酸脱氢酶(ProDH活性,从而引起Pro含量显著升高,抗盐性较强的‘长春密刺’三者变化幅度显著大于抗盐性较弱的‘津春2号’;盐胁迫下‘长春密刺’根系精氨酸脱羧酶(ADC、鸟氨酸脱羧酶(ODC和s-腺苷蛋氨酸脱羧酶(SAMDC活性升高显著大于‘津春2号’,腐胺(Put合成后迅速转化为亚精胺(Spd和精胺(Spm,而‘津春2号’根系多胺氧化酶(PAO活性升高显著大于‘长春密刺’,引起Put显著积累;随着Put积累开始降低,两品种根系Pro含量显著增加。表明盐胁迫诱导黄瓜幼苗根系较高的Pro、Spd、Spm含量和较低的Put含量有利于提高幼苗对盐胁迫逆境的适应能力,盐胁迫下黄瓜幼苗根系PAs代谢和Pro代谢密切相关,Put的积累一定程度上促进了Pro含量的增加。关键词:盐胁迫,黄瓜幼苗,脯氨酸,多胺1引言盐胁迫通过渗透胁迫、离子毒害、营养失衡等引起植物体内许多生理生化的变化[1],抑制植株生长。盐胁迫下过量无机离子的进入使得细胞内正常氮代谢紊乱[2],使之趋向积累渗透溶质的方向转变,如脯氨酸(Pro[3]、多胺(PAs[4]等含氮化合物的生物合成被明显激活,从而提高植株渗透势,以适应盐胁迫逆境。研究表明胁迫条件下植物体内Pro和PAs代谢密切相关,但研究结果仍不一致。Aziz等[5]发现遭受盐胁迫的番茄叶片外植体中,腐胺(Put和亚精胺(Spd含量降低与Pro开始积累具有一定的相关性,外施低浓度的Put能刺激Pro的积累,外施Put合成抑制剂二氟甲基鸟氨酸(DFMO能抑制Pro的积累。高浓度镉(200uM胁迫的大豆根瘤中也发现随Put含量降低,Pro含量显著增加[6]。而Frederik[7]发现过度含水导致N代谢紊乱的甜菜愈伤组织中,Pro通过降解生成鸟氨酸从而促进PAs的合成。高温伤害下,黄瓜花粉萌发过程中也发现可能存在由Pro合成PAs的途径[8]。Tonon1等[9]却认为非致死胁迫条件下,Pro和Put变化保持一致,1本课题得到高校博士点基金科研项目(20050307031;江苏省农业三项工程项目(SX(2005088资助。*通讯作者Authorforcorrespondence(E-mail:srguo@Tel:-1-只有在致死胁迫条件下,Pro和Put代谢才相互竞争。基于上述争议,本文以抗盐性不同的两个黄瓜品种为试材,研究NaCl处理对黄瓜幼苗根系Pro和PAs代谢的影响以及二者之间的关系,为弄清Pro和PAs代谢之间的关系以及探讨二者在黄瓜幼苗盐胁迫逆境适应中的生理作用提供依据。2材料与方法2.1材料与处理以抗盐性较弱的‘津春2号’(JinchunNo.2和抗盐性较强的‘长春密刺’(Changchunmici黄瓜(CucumissativusL.品种为材料。种子经消毒、浸种、催芽后播于装有石英砂的育苗盘中育苗,温室昼温25~30℃,夜温15~18℃。子叶完全展开后浇灌1/2剂量的日本山崎黄瓜专用配方营养液,待幼苗第二片真叶展平时,挑选整齐一致的植株定植于装有1个剂量的营养液水槽内(pH6.5±0.1,EC2.2~2.5,气泵通气(40min·h-1。预培养2d后,将幼苗分成两部分开始处理:一部分为正常营养液栽培;另一部分于处理当天下午6点向营养液中添加NaCl(分析纯至终浓度为50mmol·L-1。分别于处理后0、12、60、108、156小时(h取幼苗根系中部,测定Pro和PAs含量及其代谢酶活性,每处理每次取样3株,试验重复3次。试验结果均采用SAS软件Duncan多重比较法(P<0.05进行统计分析。2.2Pro含量测定采用水和茚三酮法[10]测定。2.3P5CS、ProDH活性测定吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS,EC1/1活性测定参照Song等[11]方法,以0.1ΔA440g-1FW·h-1为一个酶活力单位(1U;脯氨酸脱氢酶(ProDH,EC活性测定参照赵福庚等[12]方法,以0.01ΔA600·g-1FW·min-1为一个酶活力单位(1U。2.4PAs含量测定在刘俊等[13]方法的基础上加以改进,称取1.0g鲜样,加入3.2mL预冷的5%PCA冰浴研磨,4℃匀浆1h后,于12000×g离心30min(4℃。取上清1.0mL,加入2mol/LNaOH2.0mL和15uL苯甲酰氯,涡旋混匀,37℃保温30min后加入4mL饱和NaCl混匀,再加入2mL乙醚萃取,3000×g离心5min,取1ml醚相吹干,剩余物溶于100ul甲醇,-20℃保存待测。取10ul用DionexP680型高压液相色谱分析仪检测,流动相为64%的甲醇(超纯水配制,Kromasil反相C18柱(250mm×4.6mm,流速0.8mL·min-1,柱温25℃,检测波长254nm。以Put、Spd、Spm(精胺(Sigma公司产品作标准曲线。2.5ADC、ODC、SAMDC、PAO活性测定精氨酸脱羧酶(ADC,EC9、鸟氨酸脱羧酶(ODC,EC7、s-腺苷蛋-2-氨酸脱羧酶(SAMDC,EC0酶液提取参照赵福庚等[14]方法并加以改进,称取1.0g鲜样,加入3.2ml100mM磷酸钾缓冲液(pH8.0,内含0.1mM苯甲基磺酰氟(PMSF、1mM磷酸吡哆醛(PLP、5mM二硫苏糖醇(DTT、5mMEDTA、25mM抗坏血酸(Vc、0.1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP,冰浴研磨。12000×g离心15min(4℃,取上清液加硫酸铵达饱和度40%,12000×g离心15min(4℃,取上清加硫酸铵达饱和度60%。放置30min,再于4℃下12000×g离心20min。沉淀悬浮于3ml100mM磷酸钾缓冲液中(pH8.0,内含1mMDTT,0.1mMEDTA,0.05mMPLP,4℃下透析24h(黑暗条件。参照Kaur-Sawhney等[15]检压法进行酶活性测定,酶活性以ulCO2·g-1FW·min-1表示。△-1多胺氧化酶(PAO,EC活性测定参照汪天等[16]方法进行。以0.001OD550·min为一个酶活力单位(1U,酶活性以U·g-1FW表示。3结果与分析3.1盐胁迫对幼苗根系Pro含量的影响图1盐胁迫对黄瓜幼苗根系Pro含量的影响Fig.1Effectsofsaltstressonprolinecontentsinrootsofcucumberseedlings图1表明,两品种对照区幼苗根系Pro含量相近,处理期间无显著变化。NaCl胁迫处理,随胁迫时间延长,两品种Pro含量均呈先上升后下降的变化趋势,于胁迫后108h(4.5d时达到峰值;处理期间‘长春密刺’Pro含量升高幅度显著大于‘津春2号’,峰值处‘长春密刺’较对照相比升高了58.77%,而‘津春2号’仅升高了30.65%。3.2盐胁迫对幼苗根系P5CS、ProDH活性的影响P5CS是植物体内催化游离Pro合成的关键酶[17],ProDH是催化游离Pro降解的关键酶[18]。图2表明,两品种对照区幼苗根系P5CS和ProDH活性处理期间均保持相对稳定。NaCl胁迫处理,随胁迫时间延长,两品种P5CS活性均呈先上升后下降的变化趋势,于胁迫后108h时达到峰值,而品种之间无显著差异。‘长春密刺’根系ProDH活性于胁迫0h后即开始显著下降,胁迫末期又有所回升;‘津春2号’于胁迫后60h(2.5d才开始显著降低,且-3--4-下降幅度远小于‘长春密刺’。图2盐胁迫对黄瓜幼苗根系Pro代谢酶活性的影响Fig.2EffectsofsaltstressonPrometabolismenzymeactivitiesinrootsofcucumberseedlings3.3盐胁迫对幼苗根系PAs含量的影响图3盐胁迫对黄瓜幼苗根系PAs含量的影响Fig.3EffectsofsaltstressonPAscontentsinrootsofcucumberseedlings如图3所示,处理期间两品种对照区幼苗根系Put、Spd和Spm含量均保持相对稳定,其中Spd含量最高,约占总PAs的50~70%,Put次之,Spm含量最低。NaCl胁迫处理,随胁迫时间延长,两品种PAs含量均呈先上升后下降的变化趋势。Put于胁迫后60h达到峰值,之后迅速降低;Spd含量‘长春密刺’于胁迫后0h即显著上升,60h达到峰值,‘津春2号’仅在60h时显著高于对照,之后立即降至对照以下;Spm于胁迫后108h达到峰值。胁迫条件下‘长春密刺’Spd和Spm含量升高幅度显著大于‘津春2号’,而Put积累小于‘津春2号’。3.4盐胁迫对幼苗根系ADC、ODC、SAMDC、PAO活性的影响图4盐胁迫对黄瓜幼苗根系PAs代谢酶活性的影响Fig.4EffectsofsaltstressonPAsmetabolismenzymeactivitiesinrootsofcucumberseedlingsADC、ODC和SAMDC是PAs生物合成过程中的关键酶[19]。图4表明,处理期间两品种对照区幼苗根系ADC、ODC和SAMDC活性基本保持不变。NaCl胁迫处理,随胁迫时间延长,三种酶活性呈先上升后下降的变化趋势。ADC于胁迫后108h达到峰值;ODC于胁迫后60h达到峰值;SAMDC于胁迫后108h达到峰值。‘长春密刺’三种酶活性盐胁迫下升高幅度显著大于‘津春2号’。PAO是PAs降解过程中的关键酶[20]。处理期间两品种对照区幼苗根系PAO活性基本保持不变。NaCl胁迫下,PAO活性12h(0.5d时略低于对照,之后迅速升高,‘长春密刺’于胁迫后60h达到峰值,‘津春2号’于胁迫后108h达到峰值。胁迫后156h(6.5d时‘长春密刺’PAO活性已降对照水平以下,而‘津春2号’仍显著高于对照。-5-://4讨论Pro作为一种主要的细胞渗透调节物质，盐胁迫下大量积累是植物对盐渍逆境的一种适应，对提高植物抗盐性起着重要作用[21]。环境胁迫下Pro积累的作用是多方面的：Pro不仅可以缓解高浓度盐离子构成的渗透胁迫[22]，而且可以降低胁迫诱导的细胞酸性[23]，可以避免细胞氨中毒[24]，还可作为有机氮贮存下来，利于胁迫恢复后重新利用[25]。本试验中，盐胁迫下抗盐性较强品种‘长春密刺’根系P5CS活性显著升高，而ProDH活性显著降低，引起Pro含量显著升高；抗盐性较弱品种‘津春2号’P5CS活性升高幅度和ProDH活性降低幅度均小于‘长春密刺’，因而Pro的积累也显著小于‘长春密刺’（图1，2），表明盐胁迫下黄瓜幼苗根系Pro的积累有利于维持较高的盐胁迫抗性。PAs在生理pH下以多聚阳离子存在，可以与带负电荷的核酸、磷脂、酶蛋白等结合[26]，调节膜的生化特性以及核酸的结构和功能[27]，也可与自由基清除剂结合通过阻止脂质氧化来抵抗氧化胁迫[28]，提高植物抗逆性。植物体内PAs含量变化对盐胁迫非常敏感[2]，受到盐胁迫时，体内多胺浓度迅速发生变化[29]。研究发现，盐胁迫下高含量的Spd和Spm积累有利于缓解水稻[30]、番茄[31]、高粱[32]等植物盐胁迫伤害，但过量Put的积累却对植物造成伤害[33]。本试验中，盐胁迫下‘长春密刺’根系ADC和ODC活性的升高引起Put含量升高，SAMDC活性的显著升高促进Put合成后迅速转化为Spd和Spm，同时PAO活性只短暂升高，Spd和Spm降解速度较慢，因而Spd和Spm含量显著增加；‘津春2号’根系ADC、ODC和SAMDC活性也有所增加，但增幅较小，转化为Spd和Spm被抑制，Put而同时PAO活性显著增加，Spd和Spm降解速度较快，因而Put迅速积累，引起（Spd+Spm）/Put比值的降低。表明Put向Spd和Spm转化有利于维持黄瓜幼苗较高的盐胁迫逆境适应能力，本实验室低氧胁迫处理的黄瓜幼苗根系测定也得出相似的结论[34]。植物体内Pro和PAs代谢有共同的合成前体谷氨酸（Glu），Glu可以通过吡咯啉-5-羧酸（P5C）途径直接转化为Pro，也可以乙酰化为鸟氨酸和精氨酸，间接转化为PAs，因而环境胁迫下Pro和PAs之间存在底物竞争关系。研究表明胁迫条件下植物体PAs代谢对Pro合成代谢起着直接或间接的调节作用[35]。野生型抗盐番茄品种Lycopersiconpennellii中，Put对盐胁迫的响应早于Pro，Put含量的降低与高含量Pro的积累相一致[36]。本试验中，盐胁迫下黄瓜幼苗根系Pro升至峰值的时间晚于Put，Put于胁迫后60h达到峰值，之后随Put含量开始降低，Pro含量显著升高，于胁迫后108h达到峰值（图1，3）。表明盐胁迫下黄瓜幼苗根系Put的积累可能在一定程度上促进了Pro的增加。就其促进原因，一方面可能是Put在二胺氧化酶（DAO）作用下产生r-氨基丁酸（GABA），GABA通过氨基转换作用氧化成琥珀酸进入三羧酸循环转化为а-酮戊二酸，而а-酮戊二酸又是GS-GOGAT循环中Glu合成所必需的，从而为Pro合成提供底物[9]；另一方面Put降解产生H2O2形成氧化胁迫，进一步促进了Pro的合成[36]。综上所述，盐胁迫下，黄瓜幼苗体内较高的Pro、Spd、Spm含量和较低的Put含量对维持植株较高的盐胁迫逆境适应能力起着重要作用；盐胁迫下Put的积累一定程度上促进了Pro的合成，PAs代谢和Pro代谢密切相关。-6-://参考文献[1]GorhamJ,Wyn-JonesRG,DonnellEMC.Somemechanismofsalttoleranceincropplants［J］.PlantSoil.1985,89:15-40.[2]FriedmanRandAltmanA.Theeffectofsaltstressonpolyaminebiosynthesisandcontentinmungbeanplantsandinhalophytes［J］.Physiol.Plant.1989,76:295-302.[3]KishoreK,MongZ,MiaoGH,etal.Overexpressionofpyrroline-5-carboxylatesynthetaseincreasesprolineproductionandconfersosmotoleranceintransgenicplants［J］.PlantPhysiol.1995,108:1387-1394.[4]BouchereauA,AzizA,LarherF,etal.Polyaminesandenvironmentalchallenges:recentdevelopment［J］.PlantSci.1999,140:103-125.[5]AzizA,Martin-TanguyJandLarherF.Salt-inducedchangesinpolyamineandtyraminelevelscanregulateprolineaccumulationintomatoleafdiscstreatedwithsodiumchloride［J］.Physiol.Plant.1998,104:195-202.[6]BalestrasseKB,GallegoSM,BenavidesMP,etal.Polyaminesandprolineareaffectedbycadmiumstressinnodulesandrootsofsoybeanplants［J］.PlantSoil.2005,270:343-353.[7]FrederikLD,Jean-PierreB,ThomasG,etal.Disturbednitrogenmetabolismassociatedwiththehyperhydricstatusoffullyhabituatedcallusofsugarbeet［J］.Physiol.Plant.1993,88:129-134.[8]缪珉,曹碚生.黄瓜花药和花粉高温伤害与多胺和脯氨酸含量的关系［J］.园艺学报,2002,29(3:233-237.[9]Tonon1G,KeversG,Faivre-RampantO,etal.EffectofNaClandmannitoliso-osmoticstressesonprolineandfreepolyaminelevelsinembryogenicFraxinusangustifoliacallus［J］.J.PlantPhysiol.2004,161:701-708.[10]侯彩霞.游离脯氨酸的测定[A].中国科学院上海植物生理研究所、上海市植物生理学会编.现代植物生理学实验指南[C].北京:科学出版社,1999:303.[11]SongSQ，LeiYB，TianXR.ProlineMetabolismandCross-TolerancetoSalinityandHeatStressinGerminatingWheatSeeds［J］.RussianJ.PlantPhysiol.2005,52(6:793-800.[12]赵福庚,孙诚,刘友良,等.ABA和NaCl对碱蓬多胺和脯氨酸代谢的影响［J］植物生理与分子生物学.学报,2002,28(2:117-120.[13]刘俊,吉晓佳,刘友良.检测植物组织中多胺含量的高效液相色谱法［J］.植物生理学通讯,2002,38(6:596-598.[14]赵福庚,张国珍,张正钫,等.花生叶片衰老中多胺代谢酶活性及游离多胺含量变化［J］.植物生理学通讯,1996,32(5:351-353.[15]Kaur-SawhneyR,ShihL,FloresHE,etal.Relationofpolyaminessynthesisandtitertoagingandsenescenceinoatleaves［J］.PlantPhysiol.1982,69:405-410.[16]汪天,郭世荣,刘俊,等.多胺氧化酶检测方法的改进及其在低氧水培黄瓜根系中的应用［J］.植物生理学通讯,2004,40:358-360.[17]VerbruggenN,VillarrlleR,Van-MontaguM.Osmoregulationofapyroline-5-carboxylatereductasegeneinArabdepsisthaliana［J］.PlantPhysiol.1993,103:771-781.[18]YoshibaY,KiyosueT.Regulationoflevelsofprolineasosmolyteinplantsunderwaterstress［J］.PlantCellPhysiol.1997,83:1095-1102.[19]TiburcioAF,Kaur-SawhneyR,GalstonAW.Polyaminemetabolismandosmoticstress［J］.PlantPhysiol.1986,82:375-378.[20]何生根,黄学林,傅家瑞.植物的多胺氧化酶［J］.植物生理学通讯,1998,34(3:213-218.[21]白宝璋.植物生理学［M］.北京:中国农业科技出版社,1996.257-260.[22]史庆华,朱祝军,KhalidAl-aghabary,等.等渗胁迫对番茄抗氧化酶和ATP酶及焦磷酸酶活性的影响.［J］植物生理与分子生物学学报,2004,30(3:311-316.[23]AzizA,Martin-TanguyJ,LarherF.Saltstress-inducedprolineaccumulationandchangesintyramineandpolyaminelevelsarelinkedtoionicadjustmentintomatoleafdiscs［J］.PlantSci.1999,145:83-91.[24]朱晓军,杨劲松,梁永超,等.盐胁迫下钙对水稻幼苗光合作用及相关生理特性的影响［J］.中国农业科学,2004,37(10:1497-1503.[25]TrotelP,BouchereauA,NiogretMF,etal.Thefateofosmo-accumulatedprolineinleafdiscsofrape(BrassicanapusL.incubatedinamediumoflowosmolarity［J］.PlantSci.1996,118:31-45.[26]SmithTA.Polyamines［J］.Annu.Rev.PlantPhysiol.1985,36:117-143.[27]GalstonAW,SawhneyRK.Polyamineinplantphysiology［J］.PlantPhysiol.1990,94:406-410.[28]KramerGF,NormanHA,KrizekDT,etal.InfluenceofUV-Bradiationonpolyamines,lipidperoxidationandmembranelipidincucumber［J］.Phytochemistry,1991,30:2101-2108.-7-://[29]ZhaoFG,SunC,LiuYL,etal.Effectsofsalinitystressonthelevelsofconvalentlyandnonconvalentlyconjugatedpolyaminesinplasmamembraneandtonoplastisolatedfrombarelyseedlings［J］.ActaBot.Sin.2000,42(9:920-926.[30]RoyP,NiyogiK,SenGuptaDN,etal.Spermidinetreatmenttoriceseedlingsrecoverssalinitystress-induceddamageofplasmamembraneandPM-boundH+-ATPaseinsalt-tolerantandsalt-sensitivericecultivars［J］.PlantSci.2005,168:583-591.[31]Santa-CruzA,AcostaM,Peres-AlfoceaF,etal.Changesinfreepolyaminelevelsinducedbysaltstressleavesofcultivatedandwildtomatospecies［J］.Physiol.Plant.1997,101:341-346.[32]ErdeiL,SzegletesZ,BarabasK,etal.Responseinpolyaminetiterunderosmoticandsaltstressinsorghumandmaizeseedlings［J］.J.PlantPhysiol.1996,147:599-603.[33]PanicotM,MasgrauC,BorrellA,etal.Effectsofputrescineaccumulationintobaccotransgenicplantswithdifferentexpressionlevelsofoatargininedecarboxylase［J］.Physiol.Plant.2002,114:281-287.[34]李璟,胡晓辉,郭世荣,等.外源亚精胺对根际低氧胁迫下黄瓜幼苗根系多胺含量和抗氧化酶活性的影响［J］.植物生态学报,2006,30(1:118-123.[35]AzizA,LarherF.Changesinpolyaminetitersassociatedwiththeprolineresponseandosmoticadjustmentofrapeleafdiscssubmittedtoosmoticstresses［J］.PlantSci.1995,112:175-186.[36]Santa-CruzA,AcostaM,RusA,etal.Short-termsalttolerancemechanismsindifferentiallysalttoleranttomatospecies［J］.PlantPhysiol.Biochem.1999,37(1:65-71.-8-://EffectsofSaltStressonProlineandPolyaminesMetabolisminCucumber（CucumissativusL.）SeedlingsDuanJiuju,GuoShirong,FanHuaifu,WangSupingandKangYunyanCollegeofHorticultureNanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,210095,ChinaAbstractTwocucumbercultivarswithdifferentsalt-tolerancewerehydroponicallyculturedtostudytheeffectsofsaltstressonproline(Proandpolyamines(PAsmetabolismintherootsofcucumberseedlings.TheresultsshowedthatsaltstressinducedthesignificantaccumulationofProbyenhancingtheactivityofP5CSandinhibitingtheactivityofProDH.Tehnei‘hncumc(rnehcagsnCaghni’sogritsalt-teneclvrselgwrmrsnintni‘nhnN.’leslorcuiednseoeiicthnJcuo2(wra-tolerancelataiegfaaiotcultivarseedlings.TheincreasesofADC,ODCandSAMDCactivitiesweremuchhigherin‘hncumcselundersaltstress,whichinducedtherapidconversionofSpdandSpmintoCaghni’ediingsPut.However,theincreaseofPAOactivitywasmuchhhrn‘nhnN.’ednswhichieiJcuo2selg,giiinducedthesignificantaccumulationofPut.WiththedecreaseofPutaccumulation,Proincreasedsignificantlyintherootsoftwocultivars.ItindicatedthatthehighlevelofPro,SpdandSpmandthelowlevelofPutcouldenhancethesaltadaptivecapabilityofseedlings.PAsmetabolismcorrelatedwithPrometabolismundersaltstress.TheaccumulationofPutpromotedtheincreaseofProcontents.Keywords:Saltstress,Cucumberseedlings,Proline,Polyamines作者简介：段九菊（1981-），女，山西人，博士研究生。主要从事设施蔬菜逆境生理研究。-9-HEREDITAS(Beijing2021年7月,30(7:941―950ISSN0253-9772chinagene研究报告收稿日期:2007−12−21;修回日期:2021−01−18基金项目:“十一五”国家科技支撑项目(编号:2006BAD09A04,2006BAD09A08资助[Supportedby“11thfive-year-plan”ofChineseNationalScienceandTechnologyProgram(No.2006BAD09A04,2006BAD09A08]作者简介:郭予琦(1972−,女,河南洛阳人,在读博士生,讲师,研究方向：植物耐盐分子机理。TelE-mail:guo_yuqi@126;guoyuqi@通讯作者:钦佩(1946−,男,博士生导师,研究方向：植物耐盐机理。Telqinpei@DOI:10.3724/SP.J.1005.2021.00941盐生植物海滨锦葵幼苗盐胁迫下基因差异表达分析郭予琦1,2,田曾元1,2,闫道良1,张洁1,钦佩11.南京大学盐生植物实验室,南京210093;2.郑州大学生物工程系,郑州450001摘要:利用cDNA-AFLP技术对海滨锦葵幼苗盐胁迫下叶片和根部的基因差异表达模式进行分析和比较,并对部分盐胁迫应答的转录衍生片段进行了回收、测序和功能推测,以从转录水平分析海滨锦葵的耐盐分子机制。结果显示：(1盐胁迫下海滨锦葵幼苗叶片和根部的基因差异表达多以量的变化为主,包括盐胁迫下基因表达上调、下调或随盐处理浓度高低和胁迫时间长短而波动的差异表达模式;只有少量基因的差异表达表现出质的变化,如盐胁迫下基因沉默或诱导表达;(2仅在盐胁迫处理2h的海滨锦葵幼苗根部,基因的差异表达以质的变化为主的类型比例略高于量的变化类型比例;(3盐胁迫应答基因在不同组织中上调、下调、诱导或沉默的比例随胁迫处理时段而动态变化,在刚胁迫时基因表达的差异加剧,而后随胁迫处理时段的延长而渐趋稳定。结果预示,从基因表达水平探讨植物的耐盐分子机理,尽管有一定的规律可循,但由于不同组织对盐胁迫的应答是动态变化的过程,海滨锦葵不同组织在盐胁迫不同阶段的基因时、空、序表达特征并没有固定的程式。对部分盐胁迫下上调或诱导表达的转录衍生片段(Triviallydistributedfilesystem,TDFs进行的序列分析和功能推测表明,苗期海滨锦葵在盐胁迫下应答基因至少涉及3类：(1离子平衡重建或减少胁迫损伤相关基因(特别是运转蛋白类;(2恢复盐胁迫下植物生长和发育相关基因：如参与能量合成和激素调节途径相关基因等;(3信号转导相关基因及功能未确定的新基因。文章并对盐胁迫应答基因的差异表达模式与海滨锦葵的耐盐性关系进行了讨论。关键词:海滨锦葵(KosteletzkyavirginicaL.Presl.;盐胁迫;cDNA-AFLP;基因表达模式AnalysisofgeneexpressioninvolvedintheresponsetosaltstressinthedicothalophyteKosteletzkyavirginicaL.seedlingsGUOYu-Qi1,2,TIANZeng-Yuan1,2,YANDao-Liang1,ZHANGJie1,QINPei11.HalophyteResearchLaboratory,NanjingUniversity,Nanjing210093,China;2.DepartmentofBio-engineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,ChinaAbstract:KosteletzkyavirginicaL.Presl.isanobligatewetlandspeciesindigenoustosoutheasternUS.Itsnicheinsaltmarshforetellsitshighsalinitytolerance.cDNA-AFLPtechniquewasusedtoidentifythegenetranscriptionalprofilesofleavesandrootsfromK.virginicaseedlingsundersaltstressinordertoclarifythemoleculararchitectureofstresstoleranceinthedicothalophyte.Expressionanalysisovertimeintervalsandundervarioussaltstressesinleavesorrootsshowedthat942HEREDITAS(Beijing2021第30卷thequantitativelyexpressedpattern(inwhichgeneswerequantitativelyup-ordown-regulatedundersaltstressorfluctuatewithdifferentNaClconcentrationswasmoreprevalentthanthequalitativelyexpressedpattern(inwhichgeneswerein-ducedorsilencedundersaltstressinK.virginicaseedlingsundersaltstress.Thequalitativepatternwasappreciablymorepredominantthanthequantitativeoneonlyinrootswhenexposedtosaltstressfor2h.Althougheachexpressionpatternwasobservedinleavesaswellasinroots,thepercentageofgenes(i.e.,up-/down-regulatedorinduced/silencedundersaltstresswasdynamicallychangeableundersaltstressatdifferenttimeintervals.Alltheseresultsindicatedthattherewasnoestablishedformulaofgeneexpressionpatternsindecipheringthesophisticatedmechanismofplantsalinitytolerance,consideringthatplantsundergoaseriesofdynamicallyphysiologicalandmetabolicpathwaysinsensingandresponsetosaltstressfordifferenttissuesandduringdifferentstagesofstress.AnumberofTriviallydistributedfilesystem(TDFsup-regulatedorinducedundersaltstressfromleavesandrootsweresequenced,andthesequenceswereblastedagainsttheNCBInon-redundantproteindatabaseusingtranslatednucleotidequery(Blastx.TheTDFsfromK.virginicaseedlingsinvolvedinsensingandresponsetosaltstresscanbeclassifiedatleastintothreegroupsaccordingtotheirputativefunc-tions:(1genesforre-establishingionichomeostasisorpreventingfromdamage(speciallygenesfortransporter;(2genesforresumingplantgrowthanddevelopmentundersaltstress,suchaskeyenzymesinvolvedinenergysynthesisorhormoneregulatorypathway;(3genesforsignaltransductionandsoon.TherelationshipofexpressionpatternsoftheseTDFswiththemolecularmechanismofsalttoleranceinK.virginicawasdiscussed.Keywords:KosteletzkyavirginicaL.Presl;saltstress;cDNA-AFLP;geneexpression盐胁迫是影响植物生长发育、降低作物产量的主要逆境因素之一。盐胁迫应答基因表达模式的改变往往导致植物各种生理特性的变化。基因表达产物主要通过两种方式参与盐胁迫应答[1]：(1直接方式,通过提高植体内小分子渗透调节物、胁迫蛋白的合成量或减弱盐胁迫造成的损伤程度,直接地参与抵制盐胁迫反应以加强植物的耐盐性;(2间接方式,通过调控相关基因的表达及信号转导途径间接地参与盐胁迫反应,如降低盐胁迫下Na+的积累以提高植物的耐盐性,编码的产物多为排Na+类蛋白。以往对植物耐盐机理的认识大多来自对敏盐模式植物拟南芥的研究,但以甜土植物作为研究耐盐机理的主要对象可能会忽视某些尚未揭示的植物盐胁迫应答机制。盐生植物在长期的进化过程中可能演绎出有别于甜土植物的另类盐胁迫应答机制或调控途径,因此近年来屡见以冰草、盐芥等耐盐植物或盐生植物作为研究对象来更全面地诠释植物耐盐机理。海滨锦葵(KosteletzkyavirginicaL.是自然分布于美国含盐沼泽地带的多年生宿根盐生植物。由于其种子产量及油份含量较高,是理想的生物柴油原料,于1992年引种我国江苏省沿海滩涂地带并得到推广应用,表现较高的耐盐性[4]。早期关于海滨锦葵耐盐机理的研究仅局限于对其质膜成分中脂肪含量的分析[5],而对其耐盐分子机理尚缺乏深入认识。由于植物的根部和叶部是盐胁迫的重要应答组织,对海滨锦葵苗期不同盐胁迫阶段的基因差异表达模式的分析与比较将有助于深化对其耐盐分子机理的认识。cDNA-AFLP是在转录水平研究基因差异表达的有效技术之一,具有灵敏度高、重复性好的特点[6]。高丰度表达的基因转录本经cDNA-AFLP扩增后条带的强弱能定性地直接反映出基因表达量的差异,得到的转录衍生片段(Triviallydistributedfilesystem,TDFs可最大限度地提供基因编码区的信息[7]。作为一种研究基因差异表达的高通量技术,该方法已被应用于盐生植物互花米草(SpartinaalternifloraL.Loisel.的耐盐分子机理研究[8]。本文拟利用该技术对海滨锦葵苗期不同组织(根部和叶部在盐胁迫下的基因表达模式进行分析和比较,探讨基因差异表达模式与盐生植物耐盐分子机理的关系。1材料和方法1.1实验材料与盐胁迫处理选取饱满的海滨锦葵种子,先在70%酒精中消毒30s,然后在0.1%升汞中消毒10min。倾出升汞,用无菌水洗涤5~6次,彻底洗去残余的升汞。种子第7期郭予琦等:盐生植物海滨锦葵幼苗盐胁迫下基因差异表达分析943用无菌水浸泡过夜后置于MS培养基上萌发。萌发后的幼苗生长至两叶一心时移栽至塑料钵,用1/2Hoagland营养液栽培,移栽恢复1d后进行NaCl盐胁迫处理：浓度分别设0%(对照CK、1.0%和2.0%(NaCl+1/2Hoagland营养液,胁迫2h、6h和24h后取样测定。整个苗期的温室条件为：25/20℃(day/night,300μEm−2s−1。叶部试样均取自幼苗顶端第2片新叶(从上往下数,根部组织用自来水冲洗干净后用卫生纸擦干,所有试样用液氮浸泡后迅速置−80℃超低温冰箱备用。1.2方法1.2.1RNA提取称取试样100mg冷冻组织,按照TRIzolTM提取试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA操作说明进行总RNA提取。分别用紫外分光光度计和1%琼脂糖甲醛变性胶检测RNA的含量、质量及完整性。1.2.2cDNA合成取单链和双链cDNA的合成按照SMARTcDNALibraryConstructionKit(Clontech,K1051-1操作说明分别进行反转录和LD-PCR(LongdistancePCR。取20μg总RNA用反转录酶SuperScriptTMⅢ进行单链cDNA(sscDNA的合成,引物为SMARTⅢOligonucleotide:5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAG-AGTGGCCATTATGGCCGGG-3′;DSⅢ/3′PCRPrimer:5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-D(T30N−1N-3′,N=A,G,C或T;N−1=A,G或C。利用LD-PCR进行双链cDNA(dscDNA的合成,引物为5′PCRPrimer(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAG-ACT-3′和CDSⅢ/3′PCRPrimer。1.2.3cDNA-AFLP分析用限制性内切酶VspⅠ和TaqⅠ对dscDNA进行酶切,AseⅠ接头(VspⅠ与AseⅠ为同裂酶:5′-C-TCGTAGACTGCGTACC-3′,3′-CTGACGCATGGA-T-5′;TaqⅠ接头:5′-GACGATGAGTCCTGAC-3′,3′-TACTCAGGACTGGC-5′。预扩增引物为A0:5′-CT-CGTAGACTGCGTACCTAAT-3′和T0:5′-GACGAT-GAGTCCTGACCGA-3′。选择性扩增引物为A1:5′-GACTGCGTACCTAATAA-3′;A2:5′-GACTGCGT-ACCTAATCT-3′;A3:5′-GACTGCGTACCTAATG-C-3′;A4:5′-GACTGCGTACCTAATGT-3′,A8:5′-GA-CTGCGTACCTAATAT-3′。T1:5′-GATGAGTCCTG-ACCGAAC-3′,T2:5′-GATGAGTCCTGACCGAAG-3′,T3:5′-GATGAGTCCTGACCGAAT-3′,T5:5′-G-ATGAGTCCTGACCGAAA-3′;T6:5′-GATGAGTC-CTGACCGACC-3′;T7:5′-GATGAGTCCTGACCG-ATA-3′;T9:5′-GATGAGTCCTGACCGACA-3′;T12:5′-GATGAGTCCTGACCGACG-3′。限制性内切酶酶切、接头连接、预扩增和选择性扩增反应按照cDNA-AFLP程序(Bachem,C.W.B.cDNA/AFLP,Atoolfortranscriptomeanalysis.12thJune2002,://dpw.wau.nl/pv/aflp/protocol.pdf.。选择性扩增产物变性后进行6%聚丙烯酰胺变性胶电泳,经AgNO3染色,选择分子量为1200bp~100bp的TDFs进行统计分析。1.2.4TDF的回收、克隆与序列分析挖取盐胁迫下上调表达和诱导表达的TDFs凝胶块,置1.5mL离心管中,加入50μL重蒸水,95℃水浴15min解析凝胶中的DNA后置4℃过夜。取5μL上清液为模板,以其对应的选扩引物对回收片段进行PCR扩增。扩增条件为：94℃2min;94℃30s,56℃30s,72℃30s,30循环;72℃延伸10min。PCR产物经2%0.5×TBE琼脂糖凝胶电泳,采用Gelextractionkit(GenerayBiotech(ShanghaiCo.,Ltd,GK2041进行回收纯化。纯化的PCR产物插入pMD18-T载体(TaKaRabiotechnology(Dalian,ChinaCo.Ltd,D101A,送交TaKaRa生物技术公司进行测序。测序通过与NCBI(:///BLAST的蛋白质序列库进行BLASTX比对,依据推测的蛋白质功能对基因进行分析和归类。2结果与分析2.1盐胁迫下海滨锦葵基因差异表达模式分析2.1.1盐胁迫下海滨锦葵基因差异表达类型由选择性扩增引物A(5种和T(8种构成的40个引物组合中筛选出扩增多态性丰富的28个引物组合用于cDNA-AFLP分析,共产生约1750条TDFs,平均60条TDFs/引物组合。依据每个TDF条带在对照(CK和盐胁迫处理样品中的有、无和相对强、弱可以划分为8种基因差异表达类型(图1：ATDF在对照样品表达,在盐胁迫样品沉默;BTDF在盐胁迫样品表达,在对照样品沉默;CTDF随盐胁迫浓度增加而增强表达;DTDF随盐胁迫浓度增加而减弱表达;E1TDF只在中盐浓度(NaCl浓度1.0%处理样品表达;E2TDF只在高盐浓度944HEREDITAS(Beijing2021第30卷(NaCl浓度2.0%处理样品表达;E3TDF只在高盐浓度(NaCl浓度2.0%处理样品沉默;E4TDF只在中盐浓度(NaCl浓度1.0%处理样品沉默。其他无明显多态性或模糊条带的类型(归入Others类,见表1,表2和图2,本文不做主要讨论。从另一角度,本文把A和B表达类型归为基因“质差异”表达模式类:与对照相比,基因在盐胁迫下诱导表达(B表达类型或表达沉默(A表达类型。把C、D和E(包括E1、E2、E3和E4表达类型归为基因“量差异”表达模式类：与对照相比,基因在盐胁迫下上调表达(C表达类型或下调表达(D表达类型或随盐胁迫处理浓度高低而波动(E表达类型,其中E1和E4分别表示基因仅在中盐胁迫上调表达(E1表达类型或下调表达(E4表达类型,E2和E3分别表示基因仅在高盐胁迫上调表达(E2表达类型或下调表达(E3表达类型。图1TDF在对照(CK和盐胁迫样品处理间差异表达类型A、B、C、D、E1、E2、E3、E4表示8种基因差异表达类型。Fig.1DifferentialpatternsofTDFsamongcontrolandsalt-treatedplantsunderdifferentsaltstressA,B,C,D,E1,E2,E3,E4indicated8kindsofgenepatterns.表1盐胁迫下海滨锦葵苗期叶部基因差异表达类型及其比例Table1Percentageofdifferentiallyexpressedgenepat-ternsinleavesofKosteletzkyavirginicaundersaltstress基因差异表达类型Patterns2h(%24h(%11.710.3B13.36.9A+B“质差异”表达模式Qualitativepattern25.017.2C3.72.1D4.61.34E112.531.0E28.310.3E329.23.4E44.227.6C+D+E“量差异”表达模式Quantitativepattern62.575.87Others*12.56.93*:表示无明显多态性或模糊条带类型,本文不做主要讨论。*:Theasteriskindicatesnon-polymorphicorvaguebands,whichwasnotdiscussedinthepresentpaper.表2盐胁迫下海滨锦葵苗期根部基因差异表达类型及其比例Table2Percentageofdifferentiallyexpressedgenepat-ternsinrootsofKosteletzkyavirginicaundersaltstress基因差异表达类型Patterns2h(%6h(%24h(%A22.710.9222.6B19.06.7216.1A+B“质差异”表达模式Qualitativepattern41.717.6428.71C6.78.3810.2D4.22.947.38E111.88.827.1E28.318.211.2E34.677.7413.08E42.4315.79.4C+D+E“量差异”表达模式Quantitativepattern38.161.7858.36Others*20.2%20.58%12.88%*:表示无明显多态性或模糊条带类型,本文不做主要讨论。*:Theasteriskindicatesnon-polymorphicorvaguebands,whichwasnotdiscussedinthepresentpaper.图2海滨锦葵根部和叶部在不同NaCl浓度(0,1.0%和2.0%和不同处理时段(2h,6h和24h下基因表达的cDNA-AFLP图谱(cDNA-AFLP引物组合A4T6Fig.2ProfileofcDNA-AFLPforleavesandrootsofKos-teletzkyavirginicaL.Presl.undersaltstress(Primercombi-nation:A4T6CK,MSandHSrepresent0,1.0%(moderatesaltstress,and2.0%(highsaltstressconcentrationofNaClrespectively;M:DNAmarker(1500,1000,500,200bp.2.1.2盐胁迫下海滨锦葵苗期叶部基因差异表达分析海滨锦葵盐胁迫处理2h和24h的叶部基因差异表达类型及其比例(表1,盐胁迫处理6h因数据不完整而舍弃显示:尽管盐胁迫下叶部基因差异表达都以量差异模式为主(两时段平均为69.2%,而以质差异表达模式为辅(两时段平均为21.1%,但叶部基因第7期郭予琦等:盐生植物海滨锦葵幼苗盐胁迫下基因差异表达分析945表达量在盐胁迫下上调、下调、诱导或沉默表达类型所占比例随不同盐胁迫处理时段而各异。盐胁迫处理2h基因表达“质差异”比例高于盐胁迫处理24h约8%,尤其盐胁迫下诱导表达(B表达类型比例高于盐胁迫处理24h约1倍。尽管盐胁迫处理24h基因表达“量差异”比例高于盐胁迫处理2h约13.4%,但盐胁迫2h基因上调(C表达类型和下调基因(D表达类型表达比例分别高于盐胁迫处理24h约0.8倍和2.5倍。以上表明,植物组织对持续的盐胁迫生理应答和适应过程是随胁迫处理时段而动态变化的。2.1.3盐胁迫下海滨锦葵苗期根部基因差异表达分析根部是植物从土壤中吸收水分和营养以及遭受盐胁迫的首要器官。通过对海滨锦葵幼苗盐胁迫处理3个时段的根部基因表达分析(表2可以看出:(1在盐胁迫处理早期诱导表达及沉默的基因比例较高,如盐胁迫处理2h基因表达“质差异”比例占主导(41.7%,远高于盐胁迫处理6h(17.64%和24h(28.71%;与此相反的是,盐胁迫6h和24h时基因表达“量差异”比例显著加强(约60%,远高于盐胁迫2h(不足40%。(2持续的盐胁迫处理导致诱导表达的基因比例在经历盐胁迫2h时的较高值(19.0%后,在盐胁迫6h时回落到较低值(6.72%,随后又有上升的趋势(在盐胁迫24h时达到16.1%;在盐胁迫下表达沉默的基因比例也存在相似的变化规律。(3盐胁迫下上调表达的基因比例随处理时间的延长而稳定提高。2.1.4盐胁迫下海滨锦葵基因差异表达模式比较对海滨锦葵不同盐胁迫处理时段和不同组织的基因差异表达模式比较(表3显示:(1盐胁迫下海滨锦葵基因表达变化以量差异表达模式为主(根部和叶部平均为59.32%,以质差异表达模式为辅(平均为26.05%;(2盐胁迫处理时间短时(2h根部和叶部的质差异比例皆高于盐胁迫处理长时(6h和24h,而量差异表达模式比例规律相反;(3仅在盐胁迫处理2h时根部基因以质差异模式为主,略高于量差异表达模式比例。图2显示在不同NaCl浓度(对照和1.0%、2.0%NaCl和不同处理时段(2h、6h和24h的胁迫处理下海滨锦葵苗期根部和叶部基因差异表达的cDNA-AFLP分析图谱,其中引物组合为A4T6(叶部盐胁迫处理6h的基因差异表达谱分析因数据不完整而舍弃,图中所标示的不同差异表达类型的解释见2.1.1。表3盐胁迫下海滨锦葵苗期根部和叶部基因差异表达模式比较Table3ComparisonofdifferentiallyexpressedgenepatternsbetweenleavesandrootsofKosteletzkyavirginicaseedlingsundersaltstress表达模式Patterns叶Leaf2h(%叶Leaf24h(%根Root2h(%根Root6h(%根Root24h(%“质差异”表达模式Qualitativepattern25.017.2041.7017.6428.71“量差异”表达模式Quantitativepattern62.5075.8738.1061.7858.362.2差异表达TDFs的序列和功能分析探讨盐生植物的耐盐分子机制、筛选和鉴定盐胁迫应答关键基因是进行甜土植物耐盐性遗传改良的重要前提。为了更全面了解海滨锦葵的耐盐分子机制,对部分叶部和根部在盐胁迫下上调和诱导表达的TDFs进行了回收、克隆和测序,并通过与NCBI(:///BLAST的蛋白质序列库进行BLASTX序列比对。依据推测的蛋白质功能分析,苗期海滨锦葵盐胁迫应答基因至少涉及3类:负责离子平衡重建或减少胁迫损伤相关基因,负责恢复盐胁迫下植物生长和发育相关基因,信号转导相关基因及功能未确定的新基因等(表4。2.2.1离子平衡重建或减少胁迫损伤相关基因作为活性细胞中维持正常pH的关键转运蛋白,Na+/H+反转运蛋白可能是拟南芥基因组中最大的基因家族[9]:AtCHX17在植物受到盐胁迫、K+饥饿等作用下能够在根部上调表达;AtCHX20则在保卫细胞渗透调节过程中通过K+流动或内膜的pH调节起到关键作用;AtCHX21负责木质部N+浓度的调节,导致叶片中Na+的积累;AtCHX23作为K+(Na+/H+反转运蛋白,与植物的耐盐机制也有某种关联[13]。本研究中No.1TDF编码Na+/H+反转运蛋白,分别与Vitisvinifera,Oryzasativa和Arabidopsisthaliana的CHX基因家族蛋白质序列同源性达66%、49%和46%,在盐胁迫下海滨锦葵的根部上调表达,是否涉及Na+的外排来调节根部的K+/Na+平衡有待证实。过氧化胁迫和氧化还原的失衡往往会导致细胞受损,过氧化物酶体膜蛋白(Peroxisomalmembraneprotein,PMPs与ROS(活性氧中间体清除有关[14]。PMP是过氧化物酶体膜的主要组分,有助于膜孔的946HEREDITAS(Beijing2021第30卷表4TDFs序列与NCBI蛋白质序列库的BLASTX序列比对分析Table4SimilarityofTDFstoknowngenesbyBLASTXsearchagainstNCBIproteindatabaseNo.TDFs同源序列蛋白质Proteinshowingsignificantsequencesimilarity物种Species同源序列号AccessionnumberofsimilaraminoacidsequenceE值E-value离子平衡重建或减少胁迫损伤相关基因Genesforre-establishingionichomeostasisorpreventingfromdamage1Putativesodium/hydrogenantiporterVitisviniferaCAO658702e-432Peroxisomalmembraneprotein-relatedArabidopsis.thalianaNP_5646152e-113PMP2(PeroxisomalmembraneproteinsA.thalianaNP_5646158e-474Putativeaminoacid/polyaminetransporterA.thalianaNP_8503121e-48恢复盐胁迫下植物生长和发育相关基因Genesforresumingplantsgrowthanddevelopmentundersaltstress5Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseHelianthusannuusABG352504e-4463-ketoacyl-CoAthiolasA.thalianaBAF176e-187acyl-CoAdehydrogenaseoxidoreductaseLimnobactersp.MED105ZP019153442e-248AuxinresponsetranscriptionfactorV.viniferaCAN678974e-249Chitin-induciblegibberellin-responsiveproteinV.viniferaCAO445992e-39信号转导相关基因及功能未确定的新基因Genesforsignaltransductionorwithunknownfunctions10TransducinfamilyproteinA..thalianaNP_1887910.002*11Leucine-richrepeatreceptorproteinkinaseV.viniferaCAO698911e-1512DC1domain-containingproteinA.thalianaNP_1996431.5*13HypotheticalproteinV.viniferaCAN787963e-06*:E-值>1E-5表示没有显著同源性,推测是新基因。*:E-values>1E-5,hadnosignificanthomologyandassumedtobenovelgenes.形成及过氧化物酶体膜非特异的渗透性调节。No.2和No.3TDFs分别编码一个PMP,与A.thaliana的PMP17/PMP22基因家族蛋白质序列同源性达58%和78%。尽管2个基因在盐胁迫下海滨锦葵的叶部诱导表达,但No.3TDF在盐胁迫2h检测到基因的表达,而No.2TDF在盐胁迫24h才检测到表达。不同的氨基酸转运蛋白基因在盐胁迫下的应答方式存在差异。目前在