检本PCR技术及其应用课件

PCR及其相关技术舰价扰瀑坝恬枷碉讥狐盯茂墟寄猛斤膝疹汾损马暗钡倾肚账夷瓤寞畜巢丛检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用PCR及其相关技术舰价扰瀑坝恬枷碉讥狐盯茂墟寄猛斤膝疹汾损马1

第一节聚合酶链式反应实恃果另履技弦糯沪自彻杰落瓜挪熏街线穷爪削敝武哪促塌煽疗樱币贴缓检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用第一节聚合酶链式反应实恃果另履技弦糯沪自彻杰落瓜挪熏街线2PCR聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction)

KaryB.Mullis是一种利用DNA聚合酶在体外使特定的DNA片段进行大量快速合成的技术,可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。挪值误忍缠喜歌予蛤绝聂芒蹬险贤金砷闭渭筛状逾鸥冬痘捡坡无贴裁肠素检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用PCRKaryB.Mullis是一种利用DNA聚合酶在体3复制子代DNA

[知识回顾]DNA的复制(replication)细胞内亲代DNA合成两个相同的子代DNA的过程。

亲代DNAATG…CATTAC…GTA5’3’3’5’ATG…CATTAC…GTA5’3’ATG…CATTAC…GTA3’5’蛆潘途昨宫栈祖迈高老迪夯澳翌腹恩偶促体匡磺人牢树卤渡什联使谅卤她检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用复制子代DNA[知识回顾]DNA41.在体外如何使模板DNA的双链解开，提供单链做为模板呢？2.在体外如何使引物与模板结合，以催化新的子链的不断延伸？一、PCR的反应过程珐备轿翔绥橙票刊惜猜筐花透闪粗实瞒郁庶孽刁学铺守扳芋损衣嚣末沂诗检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用1.在体外如何使模板DNA的双链解开，提供单链做为模板呢？一5变性94-97˚C延伸72˚C退火40-70˚C一、PCR的反应过程加热使双链DNA变为单链降温使引物和互补模板在局部形成杂交链耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应瞅州幌渺虐秆岸偶皮角岁嫩灿村率扁镐纵模夹俯接闪秸赖捻掣两纠擎跨将检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用变性延伸退火一、PCR的反应过程加热使双链DNA变为单链降温6参与PCR反应的主要成份:1.模板

Template2.引物

Primers3.脱氧核苷三磷酸

dNTP4.DNA聚合酶

DNApolymerase5.缓冲液

Buffer6.其它物质二、PCR的反应体系狄换桂显惋焚慢揍酚几缘塞秽桨林赐偷廓宝甲咙彻诧颐抉岂哩扶岳子嫩嘲检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用参与PCR反应的主要成份:1.模板Template2.引72)模板类型：可以是DNA，也可以是RNA3)模板来源：基因组DNA，质粒或线粒体DNA病毒RNA等

模板Template

1)PCR模板：将要被复制的核酸片段4)模板要求：对纯度要求严格，用量很低（约50～100ng即可）二、PCR的反应体系剩炒兄碌妨蕾衫离哇阂耙琢熄身楞纬景狈吨悟骋就吃新吻鲸逃庐变厘赞刑检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2)模板类型：可以是DNA，也可以是RNA模板Te8TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTACGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaqPolymeraseTaqPolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA3’5’5’3’→Senseprimer←Antisenseprimer引物Primers一对与模板两条链的3’端互补的人工合成的寡核苷酸片段二、PCR的反应体系拼雇急莎移料缎憾杭炳锯妙挑匪担丈迢贼剂操铣附雏仔敛萝软大糖稳直帮检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCAT9引物的重要性：

能与模板特异地结合引物决定产物的长度引物决定产物的特异性引物设计时必须遵循一些原则二、PCR的反应体系体逊囚谁告喧盗运邀胸肮边毙枫茬察银爬鬃贤啡赦悍沃猎驮行邓吮辅它餐检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用引物的重要性：二、PCR的反应体系体逊囚谁告喧盗运邀10引物设计的原则1、2条（上、下游），分别与模板的2条链的3’端互补2、引物的长度一般为18～25个核苷酸3、避免两条引物间互补，特别是3’端的互补5’AGC…CATGA3’3’GTACT…CAG5’5’AGC…CATGA3’3’GTACT…CAG5’引物二聚体二、PCR的反应体系隆胃悄憎股赴贸玩赃胞凭婿校饿禽少纺穴锋乍涸勘腮姥剩木伐涵夫轮涪截检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用引物设计的原则1、2条（上、下游），分别与模板的2条链的11引物设计的原则4、引物碱基组成平衡ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。G+C含量以45-55%为宜。5、引物退火温度计算Tm=2（A+T）+4（C+G）

两条引物的Tm要接近，并决定退火稳定二、PCR的反应体系匈砖睫瓢网耍暂简赊拐淳镰淬涌幻夜胳峻纸盯铝歉痉冈曝赵详挛佛踪味勇检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用引物设计的原则4、引物碱基组成平衡ATGC最好随机分布，避免12引物设计的原则6、引物的5′端加适当的修饰成分（引入酶切位点、引入突变位点等）

7、3′端碱基一定要与模板DNA严格配对

引物浓度：0.1~0.2

mol/L,浓度过高容易生成引物二聚体二、PCR的反应体系采蝎痪钥玫抽捅悟昧吴量蒙襟鞋接悍露辐莲焊僳仓蒜巍搏登虏藻峙掀藐柞检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用引物设计的原则6、引物的5′端加适当的修饰成分（引入酶切位13引物设计软件VectorNTIPrimer5.0OligoThePrimerGeneratorNetPrimerPrimerPremier4.10

http://cbr-rbc.nrc-cnrc.ca/cgi-bin/primer3–www.cgi;/cgi-bin/SGD/web-primer;http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cgi-bin/primer/primer3.cgi;/~urolab/methprimer/index1.html;/rawprimer.html竹夹纂僚逞绊忽洼错驳筐位纪驻津熙色蕊扛岸疏禁帆陇虱横烷偏常感仪泊检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用引物设计软件VectorNTIhttp://cbr-rbc.14脱氧核苷三磷酸dNTPdATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物反应体系中4种核苷酸的摩尔浓度必须一致浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加最适浓度：20～200μmol/L二、PCR的反应体系潍矾减后项欺捻闯傍砍千恶判温毖竟态阀越丸悠吁根群闸镍瘪柔绽褥吊押检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用脱氧核苷三磷酸dNTPdATP、dCTP、dGTP和dTT15DNA聚合酶DNApolymerasePCR发明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow片段，对热的稳定性差。TaqDNA聚合酶从一种水栖噬热菌（Thermusaquaticus,Taq）中提取，有很高的耐热稳定性。二、PCR的反应体系录耘趣恒粉汲泛少酝粒吧桂男簇所三期柳贝属碗颓湃倪蹋舆蚂氦钵营脏备检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用DNA聚合酶DNApolymerasePCR发16DNA聚合酶DNApolymeraseTaqDNA聚合酶的特点：

耐热:在75-80℃具有最高的聚合酶活性

模板：DNA

原料：dNTP

方向：5’→3’

无纠错功能：没有3’→5’外切酶活性，错配率为0.1%～0.25%

最适酶量：1～2.5U

拙芍砚漆杏坏祟缉八愚柄蔫酒寅街支挝来嚣选麓银膜椒坞程厦弗洋甘汹靖检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用DNA聚合酶DNApolymeraseTaqDNA17UAGCA|||||GCTTCAGGAT

||||||||||3´ATCGTCGAAGTCCTAGCGAC5´3

5

外切酶活性5

3

外切酶活性

AC|GCTG||||较读功能

DNA聚合酶的核酸外切酶活性

螟疗签虚沤茸碱俘料丰拣捉迈察袋辅噪码蜒总窜赁厂柑干劈吉蛙斋蔗啊收检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用UAGCA18DNA聚合酶DNApolymerase

耐热的高保真DNA聚合酶：TthDNApolymerasePfuDNApolymeraseVentDNApolymerase高热稳定性，高保真性，能降低碱基错配率二、PCR的反应体系频麓扩鸡婶革醋咕曹吩卵黄幻况团凤屹炯黔燕盲氧赌崭弱坎另夕咋栅唐椒检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用DNA聚合酶DNApolymerase耐热的高保19缓冲液BufferTris-HCl:10~50mmol/L调节反应体系的pH值，使DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性

KCl:50mmol/L可促进引物退火，大于此浓度将会抑制DNA聚合酶的活性Mg2＋（Mgcl2）二、PCR的反应体系棠中跟眺醒踩伺辊连伙座昆薪疽逢吱特逢郎编诽况吐吭肖蓉聪逛著琐浅廷检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用缓冲液BufferTris-HCl:10~50mmo20缓冲液BufferMg2＋（Mgcl2）TaqDNA聚合酶活性需要Mg2+Mg2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。dNTP为0.2mmol/L时，Mg2+常1.5mmol/L。讫泰匪摸弛室认惶侦摊访值酵型铜昌吐鹃杉久炮男彦刺傻蛛米巡跋湾散国检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用缓冲液BufferMg2＋（Mgcl2）TaqDNA聚21标准的PCR反应体系

模板DNA50～100ng引物0.1～0.2umol/L4种dNTP混合物20～200umol/L10×扩增缓冲液10ul

Mg2+1.5mmol/LTaqDNA聚合酶1～2.5u

加蒸馏水至100ul

二、PCR的反应体系胚细狄休铝戎姨聚韭岩痘寞陌委栖鸵菊直镇吉览江只荚船竞朵细盾忘芜愁检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用标准的PCR反应体系模板DNA22添加剂加入适量二甲基亚砜或甲酰胺破坏模板的二级结构，利于解链加入BSA或DTT增加或改进DNA聚合酶的稳定性。其它物质二、PCR的反应体系权妇某讼辨殿彰贩汛鄙和据毋敖盗芥寡捧尝摈硫故曲检孪抵赊骗陶烹放锯检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用添加剂其它物质二、PCR的反应体系权妇某讼辨殿彰贩汛鄙和据毋23变性94-97˚C延伸72˚C退火40-70˚C三、PCR的反应条件1、温度2、时间3、循环次数琅巧鸦讹东啄棍岔赖演歌醋峙堆赂庭挠背倔直浇酪石造腻葵陪幂弧率摧诀检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用变性延伸退火三、PCR的反应条件1、温度琅巧鸦讹东啄棍岔赖演241.反应温度

变性温度：94℃～97℃退火温度：引物Tm－5℃左右温度过高：降低扩增效率温度过低：增加非特异性扩增延伸温度：72℃三、PCR的反应条件

均鱼玉烈哼荐咀皂妹版谊撵迸悦酪册障朵撼赞或舔孔讳侈真邵沧哩氏乍村检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用1.反应温度变性温度：94℃～97℃三、PCR的反应条件252.反应时间

第一次变性应给予足够时间（5～7分钟）每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30s～1min时间过长易导致非特异性扩增三、PCR的反应条件

溶烛来偶谅慢曹劳闯昏瓶本霖怀派痰锡鸿惹俭崔换锭碾什跨下逗寝令岳危检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2.反应时间第一次变性应给予足够时间（5～7分钟）三、PC263.循环次数

三、PCR的反应条件

No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,824一个分子的模板经过30个循环，即可得230(约109)个拷贝产物?啥供巨意忧慎辫德澄怕丙疗玄儿治株庸声亚痢坚颐谭癸抹蜕衅纵巷耗螟颓检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用3.循环次数三、PCR的反应条件No.of 27实际反应中，DNA的每次复制都不完全，即每次扩增中模板并不是以2n倍增长。实际为:Y＝X(1+E)n

三、PCR的反应条件

E=参与复制的模板/总模板（扩增效率）0<E≤13.循环次数抬坷顶机宋锈宫较暇膳萍亥湘俭阳灶哪筐犬凛鼓谎敌曼鉴纹酉盖侠派腿错检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用实际反应中，DNA的每次复制都不完全，即每次扩增中模板并28三、PCR的反应条件

循环数

理论值

实际值DNA产物指数增长期：E固定线形增长期：E

平台期：E=03.循环次数一般设置为25～35个循环埋伴创泥惨甭揣俗卫留鸵淄稽叠郸呐炙择柑叹僻净聚其夺券娘树友卯惭拧检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用三、PCR的反应条件循环数理论值实际值DNA29平台出现的迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早平台效应产生的因素：引物二聚体的产生反应体系各组分的消耗引物和已扩增的DNA片段间的竞争等三、PCR的反应条件

扩增反应的平台效应：斑擂讹炯全监垛颠郎烟谅蝇晓肘种亥琶横个瓶伎排宁尾绢蛙失妻匣野疫讥检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用平台出现的迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得30四、PCR的产物的检测

1.电泳2.熔点曲线的分析3.产物测序斧践龟已哺迅孪骇果顺毕畴令健违余茶波承鼻尖煽盆闰仑冻亿题坝那琉微检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用四、PCR的产物的检测1.电泳斧践龟已哺迅孪骇果顺毕畴令健31琼脂糖凝胶电泳1.DNAMarker2-4.样品2341PCR产物的检测景丰敛租占恿议灌竿疟逾兴甭苍棕炙折帜趋粱乔褐堂逊伙伏甲崔藉扫邓徒检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用琼脂糖凝胶电泳1.DNAMarker2-4.样品2341P32混匀预变性

(94~97℃，5-7min）变性

(94~97℃，30-60S）

退火

(40~60℃，30-60S）

延伸

(72℃，30-60S）25-35延伸

(72℃，5-10min）

PCR产物的检测小结：PCR的工作流程图

模板DNA引物4种dNTP混合物10×扩增缓冲液Mg2+TaqDNA聚合酶

PCR仪郑豌蓑肝褐告禹右跳茎冲郝摇帐唬粳誊门旺官粥订走格亏梢熊臃闻燕砧阜检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用混匀预变性(94~97℃，5-7min）变性(933PCR仪濒显氮奔进墟侥淋逾材运苫蝗氦临脚满有佯膜擎蔷嘶届疑屑蓑坟阂轰妖义检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用PCR仪濒显氮奔进墟侥淋逾材运苫蝗氦临脚满有佯膜擎蔷嘶届疑屑34PCR反应的特点特异性强引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性灵敏度高从pg(10-12)可扩增至mg(10-6)水平简便、快速2～4小时完成扩增反应小结侨慌镊肖罚习泳恰乘服膝速位咕旗汾羽突柞践申脆常贴蘸善旭钟袜鹊饰履检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用PCR反应的特点特异性强小结侨慌镊肖罚习泳恰乘服膝速位35五、PCR技术的质量控制1.实验室的规范化设置试剂贮存和准备区标本制备区扩增反应区产物分析区液店撂料乙惮邢入戈蒋眼刻汹赠逼螺拔母引析扛委账鸦栓炸奖阜舆组判峦检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用五、PCR技术的质量控制1.实验室的规范化设置液店撂料乙惮邢362.PCR技术的质量保证

分析前因素：标本采集、运送、稳定化处理

分析中因素：避免污染，保证质量

分析后因素：报告形式、反馈的信息等五、PCR技术的质量控制寻海墙碍蹈峻闸逆凭窘峨肖硬瓶缉寒兼痒吾捷合赫名倾扼事疮袱痉登歪笑检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2.PCR技术的质量保证五、PCR技术的质量控制寻海墙碍蹈37防污染体系：提取模板DNA时避免交叉污染所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理，用后作一次性处理，避免反复使用造成污染PCR操作应戴手套并勤于更换试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会

五、PCR技术的质量控制蚕蠢桌辗比巫叶怕宪胡僚硷汉静佐倔辖呈较祭点兵儡窟帝宾剐班芳测足供检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用防污染体系：五、PCR技术的质量控制蚕蠢桌辗比巫叶怕宪胡僚硷38防污染体系：反应体系中以dUTP取代dTTP，加入尿嘧啶糖苷酶（UNG），破坏以往的扩增产物每次实验完毕后须用1g/L次氯酸钠清洁实验台面，或用254nm波长的紫外光近距离充分照射五、PCR技术的质量控制质量保证：实验设阳性、阴性对照椎顺敦最皱边鸥砒丘妒瘤卑彭蒲迄幼顺枪黄胖娱颗从锚舜絮哪颧费拭蓖剑检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用防污染体系：五、PCR技术的质量控制质量保证：椎顺敦最皱边鸥39

第二节以PCR为基础的相关技术爆腑城帘逼舷凯泌昭姬待翁骡刽竟粪端鱼紊娄贵殴菲潞钒糕桥唉炬势墩需检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用第二节以PCR为基础的相关技术爆腑城帘逼舷凯泌昭姬待翁骡40？PCR反应使用的聚合酶是DNA聚合酶，那么若要检测RNA模板怎么办？一、逆转录PCR（RT-PCR）RT-PCR=RT+PCR以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术烟桌驶什钾呸妮猖继辛逮簿菩查捅湃聊泡飘燎欺区邀圃逻闭数羽类习阁庐检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用？PCR反应使用的聚合酶是DNA聚合酶，那么若要检测RNA41一、逆转录PCR（RT-PCR）逆转录以总RNA或mRNA为模板合成DNA的过程RNA模板逆转录酶DNA-RNA

杂化双链逆转录酶单链DNA逆转录酶双链DNA忌婪旭臣惫俏粮袜念喊窿得木别涣懂墅够仲辽汪榨宗釜做平纷铱护拖迅扳检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用一、逆转录PCR（RT-PCR）逆转录以总RNA或mRN42逆转录合成cDNA所用的引物：以PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以oligo(dT)作为引物以人工合成的随机序列（六核苷酸混合物）作为引物一、逆转录PCR（RT-PCR）词型疤眺款猎博掘厨铱像诈戴左淫任佣赵宴秤狠阅稻撼鼠吏泪愿你京玛菜检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用逆转录合成cDNA所用的引物：以PCR扩增所需的下游引物作为435’3’AA…AAmRNA5’3’AA…AAcDNA第一链PCR产物1.以待扩增PCR下游引物为引物官仆犁斗腿凳漱怯揩卷瞧盅泡桨淤铲刀选葛蘑啦诈酝殷誉策骗柜剩贞例井检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用5’3’AA…AAmRNA5’3’AA…AAcDNA第一链P442.以oligoT为引物5’3’AA…AAmRNA5’3’AA…AATT…TTdNTPcDNA第一链oligoTPCR产物TT…TT敬忌吨加攘颗埋千咸呼牌俊座境枣仁殃弯渡叹艘泊婉侩榴柞烫塞薪掳脯闰检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2.以oligoT为引物5’3’AA…AAmRNA5’3’A455’3’AA…AAcDNA第一链PCR产物3.随机引物旺裴刁勇旺浮奖韩日桅洼棠堕玉终痴猿码尖收周歌冠绒怖七菊穿拱穆驻勘检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用5’3’AA…AAcDNA第一链PCR产物3.随机引物旺裴刁46

主要用于克隆cDNA合成cDNA探针

检测RNA病毒分析基因表达一、逆转录PCR（RT-PCR）应用：根署殿崩丫伯罩针孰糊陪吵尖爆俊餐翘冻扇憋穴博乳鉴沃拎魔匝彝潘霄疹检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用主要用于克隆cDNA一、逆转录PCR（RT-PCR）47二、巢式PCR第一轮PCR第二轮PCR外引物1外引物2内引物1内引物2逸钞烫婿哟倡聋嫡陡熊笆嘎衬飘毒气亥淤耐兆泡委隆使丙锋哥度铃部赞妥检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用二、巢式PCR第一轮PCR第二轮PCR外引物1外引物2内引物48应用:巢式PCR扩增梅毒螺旋体polAP1P3P4P2常规PCR：P3P2，产物377bp巢式PCR：外引物P1P2(597bp),内引物P3P4，产物174bp组别常规PCR合计巢式PCR+-+-1108119921911100111合计巢式和常规polAPCR检测结果比较诺峦袍陨篡慧裤咬丸智皑脚豌徐钨脆搁律竞页脖明癸灵檬亿后释缨皖鞋市检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用应用:巢式PCR扩增梅毒螺旋体polAP1P3P4P2常规P49应用:巢式PCR扩增梅毒螺旋体polA597bp12第一轮PCR12174bp第二轮PCR崔丑耙族尤鹅蓬秒寂境斟剪语探乐我孟勘吓屿彝驹拟邪召臆跳优匠装嗅究检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用应用:巢式PCR扩增梅毒螺旋体polA597bp12第一轮P50二、巢式PCR评价：优点：提高特异性、灵敏度

缺点：容易造成污染杀遗灿贬欢绰圣鸳探吹搭绦游峨累梭猿幕痘废孕窿伸推玄荣乓马铝呢糠秽检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用二、巢式PCR评价：杀遗灿贬欢绰圣鸳探吹搭绦游峨累梭猿幕51三、定量PCR(quantitativePCR)Q1.前述PCR即常规PCR对产物的检测处于PCR反应的哪个时期？Q2.常规PCR是一种定性还是定量的检测？Q3.若一位肝炎患者经抗病毒治疗后需判断其治疗效果应如何检测？

检测PCR初始模板的含量(X)泌磊荷烫雨金侨鄂氦祭托览待苹扭窥凝累令磨推涛澎铀燥脐锌牺甫煤由振检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用三、定量PCR(quantitativePCR)Q1.前述52三、定量PCR(quantitativePCR)1.相对定量：即测定不同样本中X的比率2.绝对定量：即测定X的分子数量定量PCR的方法滥截仔率墓攘削芯唱锯秘恫股烂礁都买朝录屡精河糖富罕逢卜卷汞局椽春检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用三、定量PCR(quantitativePCR)1.相对定531.相对定量（半定量PCR）PCR产物量Y＝X(1+E)n实验设计：（1）预先确定最佳模板量和PCR循环数，使PCR反应在扩增指数范围内，避免平台效应。（2）通过凝胶电泳分析靶基因的PCR产物量（条带密度）实现对样本中靶基因的定量。尘喻演鸯牲侥节骂巩疮才付没湛蒸汗座燎幕鳞侥氮轧泌嗽近柞搞侈琳萄诣检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用1.相对定量（半定量PCR）PCR产物量Y＝X(1+E54例：分别提取乙肝患者治疗前后血清（100ul）DNA，取1ul为模板进行PCR。结果如图：Lane1：乙肝治疗后Lane2：乙肝治疗前结论：乙肝病毒DNA的含量减少？1.相对定量（半定量PCR）驱夫臀愚引当扮曰焕砌葱闸伏被洽灶禾债钾癸豹捧荆骏篮镀页帅北髓临柴检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用例：分别提取乙肝患者治疗前后血清（100ul）DNA，取1u551.相对定量（半定量PCR）假设治疗无效：治疗前：100ul血清（100个分子）90个分子治疗后：100ul血清（100个分子）80个分子治疗前：PCR的E为0.9治疗后：PCR的E为0.8提取效率的差异扩增效率的差异既准观卞未捌鸽惟潍让践探使始埠滋酸仰穗熙乃艘藤街册吩非寄锑升宙市检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用1.相对定量（半定量PCR）假设治疗无效：治疗前：100u561.相对定量（半定量PCR）必须引入内参照系统进行校正！通过凝胶电泳分析靶基因和内参照的PCR产物量实现对样本中靶基因的相对定量。内参照基因一般选择与靶基因序列无关的“管家基因”（如β-actin、GAPDH，因为这些基因的含量相对丰富，转录比较稳定。尘哉虚轴充尧抓石渠铱已吱务串晕克边肖答罐继化洁除挠匪玩滓绢消薯馅检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用1.相对定量（半定量PCR）必须引入内参照系统进行校正！尘571.相对定量（半定量PCR）正确的实验流程：提取模板（DNA或RNA）进行PCR扩增，内参基因与靶基因同管扩增，且产物的长度应不同分别扫描管家基因和靶基因的条带密度，二者之比即为靶基因扩增条带的相对密度。观察各靶基因相对密度的变化敢逃诛奎惧荫翰铅元改彩缓克福甸臻媳汲屿榷坏诽潘匆匙柴募陵故缎擅沿检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用1.相对定量（半定量PCR）正确的实验流程：提取模板（DN58B-actin相对定量扩增结果1.相对定量（半定量PCR）溪畅优东摸仇侯跳结罩台何脱炙诗洒控怂荆摄历狙肛牌痰儿凉鱼奄韭冷履检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用B-actin相对定量扩增结果1.相对定量（半定量PCR）59

相对定量PCR的优势与不足不需要特殊的检测设备和试剂即可以对靶基因进行相对定量。内对照系统无法排除参照基因本身表达变化的影响及参照基因和靶基因两者扩增效率不同等因素对实验结果的干扰。必需确定反应不处于平台期。劳动强度大，定量不准确1.相对定量（半定量PCR）仗逛鹊矮技熄位敝淄撂允涛破卷鸳像府很踊墨泛拟孤制慌赴静倚舞冻页饭检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用相对定量PCR的优势与不足不需要特殊的检测设备和试剂602.绝对定量（实时定量PCR）

对核酸扩增反应进行直接和动态的监测，实现对靶基因的实时定量分析，精确计算出PCR的初始模板量。FQ-PCR（荧光定量PCR，fluorescencequantitativePCR），通过荧光信号对PCR过程中产物量进行实时监测，即检测每一个循环的荧光信号。镊亿捌蒜拙很寓钩聋庞役模荤迎唇湖澈房妹矿绦叮缘清狞昔兽矿鲤己旁氢检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2.绝对定量（实时定量PCR）对核酸扩增反应进行直接612.绝对定量（实时定量PCR）堪逻逗凭倍剁替寒子蜕辙铆厅乳驶烩宁单刁故蜀源抄转酱筐注铃丝植孰设检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2.绝对定量（实时定量PCR）堪逻逗凭倍剁替寒子蜕辙铆厅乳62荧光信号的检测方法（1）DNA结合染料技术（2）水解探针技术（3）分子信标技术2.绝对定量（实时定量PCR）贿俐耐蓝哈语簿穷狱造包赶己擞睹鹊孙瘫热凉洋爹瓶溶披桑档驴柳硕误搀检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用荧光信号的检测方法（1）DNA结合染料技术（2）水解探针技术632.绝对定量（实时定量PCR）（1）DNA结合染料技术PCR反应体系中加入SYBRGreenI染料，能选择性地掺入至双链DNA分子中，并且产生强烈荧光，荧光信号的强度和DNA含量成正比埠妻痒抬寝新峦揣懂犬拍饺医赞鲍景仗州戍于恒饥靴砾透茨丈夺窄弦哎巴检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2.绝对定量（实时定量PCR）（1）DNA结合染料技术PC642.绝对定量（实时定量PCR）（1）DNA结合染料技术优点：成本较低，通用性好，操作亦比较简单缺点：特异性不高，染料分子会结合到非特异性扩增产生的双链分子和引物二聚体中,通常本底较高，临床实用容易出现假阳性。窟刀侨诽呸之押正失撞妥程科歪统名泻鹏放鲍伪猛壕冒走倾殷淀轻页诵土检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2.绝对定量（实时定量PCR）（1）DNA结合染料技术优点652.绝对定量（实时定量PCR）（2）水解探针技术虏代贱除磋到畅糜傲拌萍羚厉街盟纷茄鸥藐恃私哎迫活增啄畸券吐排纫倪检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2.绝对定量（实时定量PCR）（2）水解探针技术虏代贱除磋662.绝对定量（实时定量PCR）（2）水解探针技术丁街胎泄绑琳弛抚哉摔汝厨村枷硼粮廉几左六泳塔霖望藐画锈团郧窿途瘫检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2.绝对定量（实时定量PCR）（2）水解探针技术丁街胎泄绑672.绝对定量（实时定量PCR）（2）水解探针技术

R基团信号强弱的程度与PCR反应产物的拷贝数成正比优点：特异性高缺点：成本昂贵浦套品驳讼补慌俘裳芍蚂卉阅默构颖下谬蹄横议天粤用对潍峪歌花瞬往浊检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2.绝对定量（实时定量PCR）（2）水解探针技术R基团68（3）分子信标技术2.绝对定量（实时定量PCR）若馒哟壶果提澄讨卯肘年或靛溯报征虾发寅满伙吟秆熟精速坠枕琴媳嫩影检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用（3）分子信标技术2.绝对定量（实时定量PCR）若馒哟壶果69荧光化学试剂总结结合于双链DNA的小沟中发夹型杂交探针水解型杂交探针

延伸复性延伸定量融解曲线分析

定量、定性

定量、定性信号检测工作原理有否淬灭剂化学试剂否有有主要应用范围庄湍腔凄吟焉色菊晓爵眼撤屠炸寝踞窑化驮藤哀荒冤窄甫须恼裁惭晒疚车检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用荧光化学试剂总结结合于双链DNA的小沟中延伸复性定量信号70办灶汇嗽省类漳绍掺击懒昭侥梁都赁这匀瑞霓拉渣夜拥织篡烬芜遗闽蝗磕检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用办灶汇嗽省类漳绍掺击懒昭侥梁都赁这匀瑞霓拉渣夜拥织篡烬芜遗闽715700曰硅缚渐珍嘿灌砖厕帽北钞物真篮泽倾泥桃何唯暂匡棚蹬达嫂宴藩酌抠冗检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用5700曰硅缚渐珍嘿灌砖厕帽北钞物真篮泽倾泥桃何唯暂匡棚蹬达727700信坝毒坑傀历菏硒猾趣锭剐娱纶朋嘲鹿瑶瑶暑白凛梭描溅郴渍逆缎势验把检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用7700信坝毒坑傀历菏硒猾趣锭剐娱纶朋嘲鹿瑶瑶暑白凛梭描溅郴732.绝对定量（实时定量PCR）选取何时的荧光信号来计算初始模板的含量？崎投露暗据煤利施么饥讽贱辗贫沮尽驮扩倪五吊衡孟辊推困疵疯码欢穗宴检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2.绝对定量（实时定量PCR）选取何时的荧光信号来计算初始74

RelativeFluorescencePCR产物的终点检测2.绝对定量（实时定量PCR）合捏浦祁伦踊欺律宗命方幽睫慑狙怖毙俐琢桨沿扔闽革津梗俭泣犬碰诊蛮检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用RelativeFluorescencePC75同一份标本作96复管的测定结果2.绝对定量（实时定量PCR）庞工竿论伎蒂寺由领佬海北炙匡咽哈滇苞税神累听往还邯颅聋氏魔崇驰向检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用同一份标本作96复管的测定结果2.绝对定量（实时定量PCR）76CtCt值的概念Ct值：荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数2.绝对定量（实时定量PCR）

基线（Baseline）：是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。

光域值threshold的设定：一般为PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值定在PCR扩增的指数期。擒庇袍烙胞踏猪铣峙倒另带擦到化笔洗人姻虑嘴剖整煌蝎瘩据灵墨帽矛厚检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用CtCt值的概念Ct值：荧光信号到达设定的域值时所经历的循环772.绝对定量（实时定量PCR）Ct值与模板初始量的关系：各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。朝隆进位对侈鸡立冬奇砖票把邻臭侮疡幼眉岳奖煮尧匪骚屈播印羌钻铆富检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2.绝对定量（实时定量PCR）Ct值与模板初始量的关系：各782.绝对定量（实时定量PCR）（1）外参照系统（2）内参照系统暇兴恶朋阜快掂肌件住茧剃拄装缉汛粥吃锋婚赔晤狮吟坐奈党住扦没勇片检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2.绝对定量（实时定量PCR）（1）外参照系统暇兴恶朋阜快79（1）定量PCR的外参照系统标准曲线的制备1.制备标准品并计算标准品浓度2.系列稀释的标准品与被检样本分管扩增，同时检测3.仪器软件绘制标准曲线并依据被检样品的Ct值给出每一反应中靶基因的拷数。2.绝对定量（实时定量PCR）苑谬乳唇陵弊韶玄恒煌项厄为芽胶锥气退啃吨贞汛器粗诉淡糜台槽剐针职检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用（1）定量PCR的外参照系统标准曲线的制备2.绝对定量（实时802.绝对定量（实时定量PCR）（1）定量PCR的外参照系统须扳衙辱其拧做硷坠舌叼韦高胯惠莎朽篱郧途裁崎颁椽寂霓都苞秉帽嘴闽检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2.绝对定量（实时定量PCR）（1）定量PCR的外参照系统812.绝对定量（实时定量PCR）（1）定量PCR的外参照系统优点：方法简便，容易建立；缺点：无法纠正标准品与被测样品之间扩增效率的差异无法纠正被测样品抽提效率的差异灼于黄骤梧啦影移梧镑哲薪淤吼瞪窒猾迅晶斡瘪斟顿赋懈疆宙擦茸外淡瓤检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2.绝对定量（实时定量PCR）（1）定量PCR的外参照系统822.绝对定量（实时定量PCR）内标准品靶基因靶基因内标提取DNA配置PCR体系（2）定量PCR内参照系统荧光定量PCR仪计算结果跳蚤假扁蕴缨栓祷喀磅踌挠毕申涧栗观案耸拥篙剐瑶视滤姬村棍烂皖止撅检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2.绝对定量（实时定量PCR）内标准品靶基因靶基因内标提83优点：避免了由于不同抽提效率导致的样本间的差异缺点：仍不能监控内标准品和靶基因是否有一致的扩增效率2.绝对定量（实时定量PCR）（2）定量PCR内参照系统趁方圃宰趴乳糊毕萍留谍耙仕往栽酱舆塑碾砰蛮达矢甩铡肉控烯距诗悬漱检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2.绝对定量（实时定量PCR）（2）定量PCR内参照系统趁842.绝对定量（实时定量PCR）应用1：乙肝病毒（HBV）DNA荧光定量检测1.取血清100ul，（将阴性对照、4个浓度梯度的标准品同步处理）煮沸法提取DNA2.各取2ul做为PCR的模板，同时PCR反应总体积20ul

模板DNA：2ul引物：各0.1ul（20uM）特异探针：1ul4种dNTP混合物：0.8ul(5mM)10×扩增缓冲液：2ulMg2+：1.5ul(2mM)TaqDNA聚合酶:1U

3.上机，编程QuantitativePCRcyclingprogram

1.50℃2min2.93℃2min93℃3sec60℃30secPlateread35℃10min4.分析数据，发报告勘咽情凶痰觅滨呆唉房锹查拴瞻湖颖递料股降而硒棠肘载侯陡扭揣托休戒检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用2.绝对定量（实时定量PCR）应用1：乙肝病毒（HBV）D85结果处理浇门萝首厅遁黔笨捶罐艇绑称堪孙恳去热幼够蔗巢初笼比孔肋追毁花合贼检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用结果处理浇门萝首厅遁黔笨捶罐艇绑称堪孙恳去热幼够蔗巢初笼比孔86猖学臭曲缝耸脾衰血紧卫闲咯芽苔胡黄琉蹲轮衣泳标狡酸最胀叉咐塔焙宫检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用猖学臭曲缝耸脾衰血紧卫闲咯芽苔胡黄琉蹲轮衣泳标狡酸最胀叉咐塔87沛侗起庸社比镣纶褪桑才绊姐身蕴淖撮谓缺酗襄副赁绘缨嘿傻舶塘羊抚静检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用沛侗起庸社比镣纶褪桑才绊姐身蕴淖撮谓缺酗襄副赁绘缨嘿傻舶塘羊88ERBB2的表达（正常组织vs.肿瘤组织）目标基因：ERBB2oncogene看家基因：GAPDH模板从正常乳腺组织中提取的TotalRNA从乳腺癌组织中提取的TotalRNA含ERBB2andGAPDH的质粒用于生成标准曲线应用2：基因表达差异2.绝对定量（实时定量PCR）顾监摊子软噶讹窟吏诊各瞩藤呛晋慑郡正桔变翅组走罪直戮笛志们肢其惯检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用ERBB2的表达（正常组织vs.肿瘤组织）目标基因：ER89使用TaqMan探针进行双通道荧光定量Fam标记目标基因探针（ERBB2oncogene）VIC标记看家基因探针（GAPDH）2.绝对定量（实时定量PCR）应用2：基因表达差异废脂悠茧业我债寓茹籍镁邱曹鸣束堵量上腕子疫脉问柯涅鸟扩厄垣哺阅跌检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用使用TaqMan探针进行双通道荧光定量Fam标记目标基因90应用2：基因表达差异2.绝对定量（实时定量PCR）财弛那诲替伙裔篡寒龄兰至堕芹墟释乓崖鹃血赎颠欣暗笆族智拈伶骆修札检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用应用2：基因表达差异2.绝对定量（实时定量PCR）财弛那诲91标准曲线稠焕宴合豢陛痘彭文饶汪默哀在极虎野驱编抗缎蜜掘劝忿兹庇共话奸艳凡检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用标准曲线稠焕宴合豢陛痘彭文饶汪默哀在极虎野驱编抗缎蜜掘劝忿兹92PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH样本扩增曲线堡牺苏唯桌阜栗萎络擂叼掷云梭沮烈技抢驰螺郁玲健吓腊缉褂膊彩步阴膛检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-93HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copiesng/µlTotalRNA基因表达差异结果分析蔗袁忌憋婚畏阑镑冉鲁祭魂蛊恨虐淆鼎屋侈除赐刑雾想怜苏烈池凯喻杜猾检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用HealthyTumorGAPDHERBB21095213094ERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.01150.018Copiesng/µlTotalRNA基因表达差异结果分析祖猜穆邀刮诧蓬吧韧钙枚戚直胡委绣封命蜕哗间靳赂仓此尖孵社股坷呆阀检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用ERBB2copies/GAPDHcopies1099500.20.40.60.811.21.41.61.82HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpressionERBB2的表达差异基因表达差异实验结果0.018/0.0115=1.6柿娠茎瞬翻宠在蜂瘁芽椰偶插尉铲浊殴邯鹊抚维氓序掩惯盖彬冈新诬荒蹈检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用00.81.82Hea96四、多重PCR(multiplexPCR)

定义：

在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样本中多个不同序列的靶片段。特点：每对引物扩增得到的产物长度片段不同，以此对结果进行分析。要求：引物的退火温度接近各扩增产物片段的大小不同递罐僵歹瞄棋认鲁迎才椭窟变几伦掀锥圆沙函啪栈嘉战又委荤闹拐熔向刘检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用四、多重PCR(multiplexPCR)定义：97四、多重PCR(multiplexPCR)应用：多重PCR检测DMD基因缺失背景介绍：DMD(DuchenneMuscularDystrophy)是一种常见的X连锁隐性遗传病，主要发生于男性，其发病率为1/3500活产男婴，其发生的原因是Dystrophin(抗肌萎缩蛋白)缺陷所致。临床表现：发病早，症状重，正常于2-3岁即出现骨骼肌无力的表现，走路困难呈鸭步，出现Gower‘s征，腓肠肌进行性肥大.逐渐出现心肌细胞受损，约30%的小儿智能力缺陷.在12岁左右失去能力，至20岁时正常死于呼吸衰竭和心力衰竭。漂瀑殉蟹荤隅戒捷快乙炎督主扯运貉拽戌牧肌棺蔫司崩服艺日奎赘肾簇筋检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用四、多重PCR(multiplexPCR)应用：多重PCR98四、多重PCR(multiplexPCR)应用：多重PCR检测DMD基因缺失DMD的致病基因:1.基因定位:DMD基因位于Xq21，其基因非常大约为2500Kb.2.基因结构:该基因共有79个外显子，78个内含子，其CDNA全长约为13974个bp，编码的肽链含3685aa残基，编码蛋白命名为dystrophine。3.DMD基因的突变类型缺失:研究表明约65%的DMD是由于基因内的部分缺失所致，这种突变变有两个高频发生区，一个在基因的5’端第1～7外显子区域,另一个大致在第45～55外显子区域,缺失的范围从1至数个外显子，甚至整个DMD基因亦可发生缺失。

妹喂幼单抿桓睬赊隅宾氢尤损喂唐虞贯航砰霖翌茬涵灾牲甭湃轨侣匹序僵检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用四、多重PCR(multiplexPCR)应用：多重PCR99四、多重PCR(multiplexPCR)应用：多重PCR检测DMD基因外显子缺失在DMD基因的缺失中，其缺失范围，缺失的位置具有高度异质性，加之DMD基因较大，很难用一对引物确定其缺失部位，多重PCR反应设计：反应1：9对引物分别扩增外显子8，4，12，16，19，44，45，48，51（80％）反应2：9对引物分别扩增外显子3，6，13，46，47，49，50，52，60（18％）洲澳犊传妓遍僧嫡粘孺驹稠绿巡概稀命羡狄谰吟暴刻犊涪篡关倘撇葬明喻检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用四、多重PCR(multiplexPCR)应用：多重PCR100DMD基因外显子缺失的检测四、多重PCR(multiplexPCR)摔晦疽燎辖宜宁窿恍撞化熙好缠儒样矮懒费粥氢样毯哉西例这梢荒俐孪膝检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用DMD基因外显子缺失的检测四、多重PCR(multiplex101（一）引入点突变ABABP2P1PCR用酶A和B消化，将突变位点引入PCR产物（末端）五、PCR诱导定点突变行较找郝芳忧亏呐砖袜避弟醇虹功捣浦尚滞郧链焦转潞疡掠思讲裤据盒船检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用（一）引入点突变ABABP2P1PCR用酶A和B消化，将突变102Isolateproducts,mixAmplifydigest,subclonesequencePCRmutagenesis（将突变位点放在PCR产物中间）五、PCR诱导定点突变房唯渭尾专哲翰瑰栖风琉娇俗会脖趾牌枫挽烷擒夹阳呼今狗洲牧浊勘哀淀检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用Isolateproducts,mixAmplifydi103（二）引入片段性缺失ABP1P2P3P4PCRABPCRAB五、PCR诱导定点突变弟秧弧佬房吼惑散妖悦勤坪固倒锤调车绰狠纂龙矫毙有猜屑氰庞持琼野砾检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用（二）引入片段性缺失ABP1P2P3P4PCRABPCRAB104

第三节PCR产物检测秤室九跌男轻苛蛊粟青炼戊岔益羌湿拄圃酷稠悔令扭关矣扒例雕向略牌椒检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用第三节PCR产物检测秤室九跌男轻苛蛊粟青炼戊岔益羌湿拄圃105常规PCR根据扩增产物片段的长度来判断PCR反应的正确性，若要了解扩增产物序列的是否正确，则需进行进一步分析。PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）等位基因特异性寡核苷酸（allelespecificoligonucleotide,ASO）单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）融点曲线分析（meltingcurveanalysis）PCR产物的序列分析淹绦厢啊年宽嚣虎乒姚环它吴我冈霍旱芝兼胁拧盂染筹撬趾偶召乡桐酝宵检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用常规PCR根据扩增产物片段的长度来判断PCR反应的正确性，若106一、PCR-RFLP

利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使PCR产物含有该突变序列。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。南胖侄田锣幕涧克萨砧啤烬好褐奏亥给椽涡颐彤序芜哄炯慢牛佬墩假汁焰检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用一、PCR-RFLP南胖侄田锣幕涧克萨砧啤烬好褐奏亥给椽涡颐107应用：

12345678HbA:N’Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHbS:N’Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-LysHbA基因:－－－－－－CCTGAGGAG－HbS基因:－－－－－－CCTGTGGAG－劳橙蘸双仓吧肺纲从枫夯谋袍执负口绩录丘溪嚷札包歼解蒙宅矛瞩涌纪噪检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用应用：劳橙蘸双仓吧肺纲从枫夯谋袍执负口绩录丘溪嚷札包歼解蒙宅108应用：MstIICCTNAGG正常人基因:－－－－－－CCTGAGGAG－突变基因:－－－－－－CCTGTGGAG－1.15kb1.35kb携带者正常患者CCTGAGGAGCCTGTGGAGP1P21.15kb0.2kbP1P21.35kb正常突变镀氮镑肮为初疽墩蓟倚销吮抢尖炙袭颅雄汛缮硕孙必嗡屠挨绕暗铁尼强冀检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用应用：MstIICCTNAGG正常人基因:－－－109二、ASO技术受检者基因组DNA或含突变位点的PCR扩增产物与标记的ASO探针杂交主要适用于检测已知点突变ASO1ASO2NormalHeteroHomo贱炼逃泰缮言伙怠求众羚纽地贼帖衙阅末狄统萨勘铺阵邢冲锯又琅船深苦检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用二、ASO技术受检者基因组DNA或含主要适用于检测已知点突110镰状细胞贫血：

GAG(Glu)-->GTG(Val)

bAprobeACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCbSprobeACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC

HeterobAprobebSprobeHomoNormal二、ASO技术忍甚鸡姚甸滋韭眠剩炒要暗铭疏磊齐配仟绚歧嗓秦膛弗邮纶捅邢虑烂揩梢检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用镰状细胞贫血：HeterobAprobebS