主栽发酵型发酵型发酵质量指标下的发酵应用遗传多样性分析

主栽发酵型发酵型发酵质量指标下的发酵应用遗传多样性分析

芋头主要种植在热带地区，是东南亚和太平洋地区的重要作物。芋头的种植量在食根作物中位于马铃薯、木薯、甘薯和山药之后,位列第五。据国际粮农组织2011年报告,2009年世界芋头产量1100万t,中国的产量位列第二;2008年中国芋头出口位列第一,每年4.9万t。芋头依食用部位不同,分为叶用变种及球茎变种。球茎变种主要分为2种类型:魁芋类和多子芋类。芋头是高度多态性的物种,进行无性繁殖,为异花受粉。已存在的大多数品种至少是部芋头疫病由卵菌门的芋疫霉菌(PhytophthoracolocasiaeRacib)侵染所致。疫病是芋头生产过程中的一种主要限制因素,可引起芋头减产25%~30%。国外已有许多收集芋头品种,并鉴定其疫病抗性的报道,已从芋头品种中鉴定出9种抗疫病的基因,用AFLP对印度芋头品种进行了遗传多样性分析,并找到了与疫霉病抗性基因连锁的分子标记。国内还未见芋头品种抗疫病的报道。本研究对从广东、广西、湖南和湖北等主要芋头产区收集芋头品种进行了疫病的抗病性鉴定,并用SSR对这些抗性芋头材料进行了遗传多样性分析,旨在促进芋头品种的遗传改良和保存其种质资源。1材料和方法1.1从芋头品种中收集食物从广东、广西、湖南和湖北等主要芋头产区收集芋头栽培品种和野生种,种植于广东海洋大学农学院实验田中。1.2培养菌株为疫霉菌芋头疫霉菌的分离参考李智军等的方法。从芋头发病田块采集具有芋头疫病典型症状的病叶,切取病健交接部位2~3小块,置于含抗生素胡萝卜培养基(CA)平板(青霉素50mg、利福平100mg、胡萝卜200g榨汁、琼脂20g/L)上,25-28℃培养2d后,挑取菌落边缘菌丝少许,转接至不含任何药剂的CA培养基上在同样温度条件下培养3-5d。经形态学观察培养菌为疫霉菌。保存菌种作抗病性鉴定。1.3病斑直径测定用疫霉菌来鉴定不同品种的疫病抗性,鉴定方法参考Brooks的方法,并加以改进。具体如下:将培养3~5d的疫霉菌用打孔器打直径为0.5cm的菌块。选第二或第三最嫩的叶片,在叶片的背面,接种一菌块,用透明胶成十字型封住菌块,接种5d后,测定病斑的直径,以此作为芋头抗疫霉菌的标准。每个材料接种4张叶片,选择一致性较好的3张叶片测量病斑直径。抗病鉴定于2011和2012年在广东海洋大学农学院实验基地进行。1.4馒头ssr标记扩增多态性选择抗病品种和部分感病品种,用改进的CTAB法提取基因组DNA。调整各DNA的浓度至10ng/μL。根据Emma等开发的芋头SSR标记,选择扩增效果好、在芋头上有多态性、及扩增等位基因数少的SSR引物进行芋头遗传多样性分析。所选择的SSR标记见表1。将有某一等位基因条带记作1,没有该某一等位基因条带记为0。利用软件NTSYS计算材料两两间的相似系数,并进行聚类分析。2结果与分析2.1感病品种的确定将2a抗病性结果分别进行单因素方差分析,2011年和2012年的F值分别为22.75和22.53,均比F62,124=1.45大,说明各品系间抗病性差异显著。参考Singh等离体鉴定芋头对疫病的抗性指标,将田间芋头抗病性的标准定为:直径大于40mm为感病,31~40mm为中等抗病,小于20mm为抗病。如果2a的直径差别不超过20mm,但直径跨越2个抗性标准区间,取平均值后确定其抗性;如果2a的结果差别超过20mm,其抗性定为未知(表2)。在这些品系中,抗病品系只有6个,分别为广州-2、江门-2、湛江-5、湛江-6、湛江-9、北海-1,占9.5%;中抗9个,分别为高州-1、连州-1、罗定-2、梅州-2、汕头-3、遂溪-2、吴川-1、贺州-2和兴安-2,占14.3%;感病品系42个,占66.7%;有6个品系2年鉴定的结果差别较大,因此将其抗性定为未知。这些抗性品系中,江门-2为野生芋和湛江-5为食叶芋。其余13个抗病品系中,梅州-2、汕头-3和吴川-1为魁芋,其余10个品系为多仔芋。2.2抗侧品种聚类分析选取全部的抗病品系及分别代表不同地区的品系37个,用表1中的11对引物进行遗传多样性分析,结果只有5对引物uq55-112、uq56-191、uq73-164、uq91-262和uq110-283能扩增出多态性,一共可扩增10条有多性条带。其中uq73-164扩增的结果如图1所示。数据用软件NTSYS进行聚类分析后结果如图2。聚类分析结果(图2)表明,芋头品系在聚类系数0.3左右时,芋头品系可分为5个类群。在15个抗及中抗的品系中,10号江门-2为野生芋,37号湛江-5为食叶芋。它们的亲缘关系较近,属于第5类群,与其它类群的亲缘关系较远。其余各抗病品系分属其余4个类群。3讨论3.1田间接种方法的确定采用2种抗病性鉴定指标,侵染频率和病斑直径,认为离体叶片接种法是一种简洁快速鉴定芋头的疫病抗病性方法,接种后5d的病斑平均直径是鉴定疫霉菌的有效指标。Birhman和Singh也认为病斑的大小是鉴定马铃薯晚疫病抗性最重要的指标。离体抗性的鉴定结果并不总是很好地与田间鉴定的结果相吻合,其原因可能是芋头的生长状况、抗性鉴定的方法和病原物的差异。本研究在前人的基础,将田间接种的方法由接种一定浓度的疫霉菌孢子,改为接种直径为0.5cm大小的菌块。芋头疫霉菌的鉴定指标由发病叶片的百分率改为病斑直径。该方法比原来芋头疫霉菌接种方法更为简便,可较准确地鉴定出芋头对疫霉菌的抗性。在抗病性鉴定过程中,2a的抗病性鉴定结果大多数相吻合,但还有少数品种的抗病性在2a间有较大的差异,其原因可能是寄主的抗性,除取决于寄主本身,还受地上部菌原量和环境条件(温湿度、土壤、块茎在土壤中分布)、栽培措施等多种因素制约。3.2ssr标记多态性分析我国芋头主产区珠江流域、长江及淮河流域,有大量的芋头品种。许多种植者不知道所种植的芋头品种的名称,这不利于芋头品种的收集、抗病性鉴定及核心种质资料库的建立。国外在建立芋头的核心种质资源库时,使用显性的稳定的农业性状可对芋头品系进行初步分类。在此基础上,可进一步利用分子标记,对这些品系进行遗传多样性分析,在保证遗传多样性的前题条件下,极大地减少所需保存的芋头品种。因此有人用形态学标记,辅助以AFLP标记或RAPD标记对芋头进行了分类从而建立核心种质资源。与AFLP、RAPD标记相比,SSR标记具有更加简便、可靠及共显性等特征,因此国外有人利用形态学性状和SSR标记对芋头进行了分类从而建立核心种质资源。本研究从我国南方4个主要芋头种植区收集了100多个芋头品系,经根据形态学性状初步将芋头进行了选择,将芋头品系减少到60多个,并进行了疫病的抗病性鉴定。筛选出8个抗或中抗的品系,这些品系可直接用于生产上来防治芋头疫病,或作为抗源加以利用,它们还为进一步研究芋头抗病的分子机理提供材料。