基于分级补料法的玉米秸秆酶解糖化工艺优化

基于分级补料法的玉米秸秆酶解糖化工艺优化

通过热化学和生物化学等途径，现代工业生产通过多种先进的转化技术，生产固、液、气等尖端能源，并利用能源装置为人类生产和生活提供能源。木质纤维素的高效水解是实现其转化为生物燃料和生物制品关键技术之一,如生物乙醇、生物丁醇、生物制氢等都是建立在木质纤维素高浓度水解糖平台基础之上。因此,开展高效的木质纤维素糖化技术研究是实现高值化利用的重要途径。在纤维乙醇研究领域中,纤维素原料高浓度还原糖水解液的获得有利于提高后期乙醇高浓度发酵并降低乙醇蒸馏的能耗和经济成本。由于木质纤维素原料质地疏松、能量密度小、浸水性差等特点,致使一次性加料固形物浓度较低,水解还原糖浓度处于较低水平。Rudolf等认为分批补料法可以提高水解液糖浓度,是一种解决乙醇发酵浓度较低有效的途径之一。目前,基于木质纤维素酶水解机理模型,围绕木质纤维素高浓度水解液的技术体系优化,降低或消除水解过程中产物反馈抑制效应已经成为研究的重点之一。Pristavka等研究了在非连续搅拌反应器中,21%的秸秆固形物,纤维素添加量42FPU/g秸秆,还原总糖浓度达到160g/L。赵晶等采用分批补料酶解工艺,使底物最终质量浓度达到200g/L,纤维素酶20FPU/g(底物)和纤维二糖酶6.5CBU/g(底物)酶解60h后还原糖浓度达到116.3g/L,酶解得率达到80.1%。虽然纤维素高浓度水解技术并取得了一定进展,但仍然存在两个较为突出的问题:一是纤维素酶用量大,酶的添加量通常为20~45FPU/g原料;二是还原糖浓度较低,通常在100g/L以下,且糖化时间较长,这些不利因素制约纤维乙醇产业化发展进程。本研究针对纤维素高浓度水解过程中酶加载量较高和糖化周期较长等问题,以稀硫酸预处理的玉米秸秆为原料,采用分批补料糖化的方法,对影响纤维素高浓度水解液的条件进行优化,有利于构建木质纤维素的高浓度水解技术体系。该补料糖化方法的建立,为以后纤维液体燃料工业化生产中补料控制提供了有益的启示和参考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1原材料玉米秸秆:取自河南农业大学北郊科教试验园区,粉碎100~200目,水分含量12%,经测定原料及其预处理后的主要成分含量如表1所示。1.1.2木聚糖酶cmc纤维素酶:购自无锡杰能科生物工程有限公司,滤纸酶活180FPU/mL。木聚糖酶:购自无锡杰能科生物工程有限公司,CMC酶活4.5×104U/mL。果胶酶:购自宁夏和氏壁生物技术有限公司,酶活5.0×105U/g。1.2方法1.2.1醋酸酶解醋酸钠缓冲液的制备每次准确称取玉米秸秆原料10g放于300mL三角瓶中,平行3次,用1%稀硫酸溶液浸润,初始固形物含量为20%(W/V),121℃处理60min后,冷却至室温,在pH4.8醋酸-醋酸钠缓冲液进行酶解。原料酶添加量为:木聚糖酶220U/g,纤维素酶6FPU/g,果胶酶50U/g,温度45℃,转速为120r/min,每隔24h测定还原糖浓度。1.2.2冷却、干燥补料原料:玉米秸秆原料经1%稀硫酸,固形物含量为20%,121℃处理60min后,冷却至室温,抽滤,105℃烘干备用。补料糖化:从一次性加料糖化实验中得到的最佳条件作为补料糖化过程的最初含量,每隔24h对原料进行补料,补料前测定还原糖浓度。补酶量:每克补加原料酶添加量为木聚糖酶20U/g,纤维素酶2FPU/g。1.3酶活、酶活、纤维素、纤维素的测定纤维素酶酶活测定:采用QB2583-2003测定。木聚糖酶酶活测定:采用GB23874-2009测定。果胶酶酶活测定:采用QB1502-92测定。纤维素、半纤维素、木素的测定:采用范氏(VanSoest)纤维测定法。总还原糖浓度测定:采用DNS法测定。2结果与分析2.1比对补料糖化的影响纤维素酶降解发生在固、液相界面较为复杂的过程,影响这个动态过程的因素有很多,一方面与纤维素自身的结晶区类型、聚合度、分子质量有关;另一方面与水解液的理化性质及酶作用表面结构的吸附与解析等密切相关。首先考察了液固比对补料糖化的影响,从图1可以看出,当液固比为5,即固形物含量为20%(W/V)时,间隔24h进行分批补料,48h和72h时还原糖浓度分别为108.7g/L和117.6g/L,比对照相应增加了20.8g/L和23.0g/L,表明随着分批补料的添入,还原总糖的浓度显著增加,但还原总糖增幅减少。从图2可以看出,当液固比为6,48h和72h时还原糖浓度分别为89.8g/L和106.2g/L,比对照相应增加了3.6g/L和13.2g/L。图1和图2结果表明通过分批补料的方法可以获得较高浓度的还原总糖,表明分批补料可以提高促进水解液中游离态的酶吸附与底物的降解,从而提高糖化体系中酶的利用效率,降低酶的相对使用量。2.2l和84.7g/l在进行液固比对分批补料糖化影响的基础上,研究了分批补料料量对糖化体系的影响。如图3所示,一次补料糖化结束后,补料4%(W/V)、6%(W/V)和8%(W/V)还原糖与对照相比分别增加了15.5g/L、26.1g/L和44.7g/L;表明随着一次分批补料量的增加,还原总糖的增幅相对增加;二次补料糖化结束时,补料4%(W/V)、6%(W/V)和8%(W/V)还原糖与对照相比分别增加了34.6g/L、46.7g/L和58.0g/L,但在这一补料糖化阶段,补料6%(W/V)与8%(W/V)相比,增量分别为21.5g/L和13.6g/L,表明随着二次分批补料量的增加,还原总糖的增幅相对减少,这与水解液体系中增加木质素含量浓度相对增加有关,以致影响固、液相界面游离态酶的可及性,这与Zhao等和Mosier等对纤维质高浓度糖化水解的研究结果相一致,随着酶解糖化的持续进行,不易降解的底物如木质素,部分结晶度较高的(半)纤维素可能阻碍酶的吸附和解吸效率。2.3补料量对还原糖含量的影响基于分批补料量不同对糖化的影响,研究同时分别补料与酶的研究,通过少量的酶,以增强底物对酶的吸附与解吸附问题,从而有利于提高底物的转化率,获得高浓度的纤维素水解液。从图4中可以看出,一次补料同时补酶时,产生的还原糖浓度比只补料产生的还原糖浓度分别提高13.5g/L、15.8g/L和16.6g/L。经过二次补料补酶后,补料4%(W/V)、6%(W/V)和8%(W/V)时还原糖浓度分别为116.2g/L、122.5g/L和138.5g/L。结果分析表明随着补料量的增加,产生的还原糖浓度也在增加,在经过一次补料补酶后,不同的补料量产生的还原糖浓度基本相同,还原糖浓度都增加了约25~27g/L。从二次补料补酶的结果中可以看出,在48~72h水解过程中,补料8%(W/V)还原糖浓度达到138.5g/L。试验结果表明,糖化过程中分批补料补酶工艺可以有效提高还原糖的浓度。3木聚糖酶催化反应本研究以稀硫酸预处理后的玉米秸秆为原料,采用分批补料工艺方法,对影响纤维素高浓度水解液的条件进行优化。结果表明:固形物含量为20%(W/V)玉米秸秆经1%稀硫酸溶液浸润,121℃处理60min后,冷却至室温,在醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.8)中进行,原料酶添加量为木聚糖酶220U/g,纤维素酶6FPU/g,果胶酶50U/g,温度45℃,转速为120r/min开始进行糖化,糖化24h和48h后分别向水解液中加入8%的物料和补料量相应的木聚糖酶20U/g(底物),纤维素酶2FPU/g(底物),糖化72h后水解液最终还原总糖达到138.5g/L,原料的酶解率最终达到理论值的62.5%。纤维素原料高浓度水解液的获得是实现其高浓度发酵并降低纤维乙醇生产成本的必要条件。本实验室以前对一次添加秸秆原料的酶解条件进行了研究,结果表明原料可以达到较高的酶解效率,但水解液中还原糖浓度仅为48.5g/L,水解糖的浓度始终处于较低的水平。采用与本研究中相同的预处理条件和酶解条件,对稻草秸秆酶解72h后,水解液中还原糖浓度为84.22g/L。本文基于补料糖化策略,通过分批添加底物的方式获得了较高还原糖浓度的纤维素水解液。与以前的非补料糖化72h实验结果相比,表明补料法可以显著提高还原总糖浓度。该结果与赵晶等研究结果相比,减少了纤维酶用量,还原糖浓度提高了19.1%,但原料的酶解率降低了17.6%。在木质纤维素