血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定崔福爱

实验二血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定崔福爱生化与分子生物学研究所层析技术实验原理实验思路实验流程及操作注意事项1．层析法：层析法也称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术,是1903年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3

吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。

用色彩（chroma）和图谱（graphs）组成色谱一词（Chromatography)层析技术2.

依据：利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数等），而最终达到对物质进行分离纯化和分析鉴定的目的。

固定相—固定不动

流动相—对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。3．基本原理：固定相和流动相4．分类：

①流动相的物理状态：气相和液相

→

气液/固，液固/液

②方式：纸、薄层、柱

③原理：吸附、分配、凝胶、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相5．凝胶层析

(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析)

①定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。②基本原理：

固定相：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。

流动相：洗脱液交联葡聚糖凝胶多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构球状颗粒，商品名为SephadexG系列G—交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200八种，具体含义为吸水量（g）/10g干胶交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水性大。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。凝胶层析的基本原理样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作垂直向下运动和不定向扩散运动→小分子可进入凝胶空内部，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶空内部，颗粒间移动，流程短，先流出→大小分子彼此分开

③影响因素层析柱的选择及装填：

柱大小—分离样品量凝胶型号—分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子。洗脱液：溶解待分离物质，不变性加样量：1%～5%凝胶的再生凝胶型号颗粒大小（μm)溶胀体积(ml/g)分离范围（Mr）G-1040～1202～3＜7×102G-1550～1502.5～3.5＜1.5×103G-2550～1504～61×103～5×103G-5040～1209～111.5×103～3×104G-7540～12012～153×103～8×104G-10040～12015～204×103～1×105交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数实验原理透析及超滤法盐析、有机溶剂/免疫沉淀电泳凝胶层析离子交换层析超离心共性：

*生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析

*蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化膜和电荷→盐析/有机溶剂沉淀

*两性电解质和等电点：pH>pI，蛋白质带负电；反之带正电→电泳、离子交换层析

*有一定的功能：抗原性→免疫沉淀

个性：蛋白质的分子量、等电点、亲水程度、形状不同分离依据：蛋白质理化性质的共性和个性实验思路盐析去除杂蛋白凝胶层析脱盐交联葡聚糖吸水浓缩醋酸纤维素薄膜电泳鉴定上午完成下午完成先粗后细取血清1.0ml于小试管中，加入洗脱液1.0mL摇匀，再逐滴加入1.0mLpH7.2饱和(NH4)2SO4溶液边加边摇。静置5min后，3000rpm/min离心10min。倾去上清液。将沉淀用1.0mL洗脱液搅拌溶解，再逐滴加入0.5mL饱和(NH4)2SO4溶液，混匀，于室温放置5min。3000rpm/min离心10min。倾去上清液。沉淀用0.3mL洗脱液溶解，即为初步纯化的γ-球蛋白溶液。饱和(NH4)2SO4溶液边加边摇(逐滴加入！),使用小试管。实验流程及操作注意事项1.初步纯化：盐析盐析的原理：蛋白质溶液中，加入高浓度中性盐，破坏蛋白质溶解的2大因素（电荷，水化膜），使其沉淀析出。中性盐：硫酸铵，硫酸钠等蛋白质复溶：加入低盐浓度缓冲液控制盐溶液的浓度可以沉淀出不同的蛋白影响因素：

温度：温度与溶解度成正比。一般室温即可,少数温度敏感型蛋白质需4℃操作，而血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25℃比0℃时溶解度低，更易盐析。

pH值：大多数蛋白质在pI时溶解度最低。pH=pI效果更好。

蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐析前血清加等量生理盐水稀释，控制