生物芯片的研究与应用教学

生物芯片研究与应用黄燕huangyan@.付旭平xupingfu@生物芯片的研究与应用教学第1页教学内容基因芯片原理一些重点基因芯片类型介绍基因表示谱芯片生物信息学基因芯片表示谱数据分析基因芯片在“组学”中应用其它类型基因芯片和生物芯片介绍生物芯片的研究与应用教学第2页关于考试期末考试占60％：开卷平时成绩占35％：选取文章解读（作业），课堂讲解点名计5％生物芯片的研究与应用教学第3页PLOSBIOLNEWENGLJMEDMOLSYSTBIOLNATREVCANCERTRENDSGENETNATGENETNUCLEICACIDSRESCANCERCELLGENOMEBIOLJCLININVESTBIOINFORMATICSEMBOJBMCGENOMICSCANCERRESBMCBIOINFORMATICSONCOGENESYSTEMATICBIOLMOLBIOLCELLPLOSCOMPUTBIOLAMJHUMGENET生物芯片的研究与应用教学第4页参考书目高新技术科普丛书《基因芯片技术——解码生命》，化学工业出版社，5月。《基因芯片与功效基因组研究》，化学工业出版社，7月。《基因芯片数据处理与分析》,化学工业出版社,年7月生物芯片的研究与应用教学第5页生物芯片概述第一讲生物芯片的研究与应用教学第6页生物芯片出现生物芯片概念起源于计算机芯片微处理芯片是由硅、锗等半导体材料经微电子加工技术制作集成电路设备，将不一样功效单元集成在一块微型器件上；生物芯片只是一个执行生物检测和分析微型设备从起源和制造工艺来说，生物芯片还是与微处理芯片有一定渊源关系。早期微处理器芯片制造经历了由大变小过程，使微电子工业发生质飞跃微处理器芯片这种制造上微型化启发了生物学家思绪，使他们产生了用微电子平板印刷技术制造用于生命科学研究和医疗诊疗微型仪器想法，从而造成了生物芯片出现生物芯片的研究与应用教学第7页基因芯片是生物芯片代表生物芯片的研究与应用教学第8页基因芯片发展历史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray生物芯片的研究与应用教学第9页基因芯片标志性事件Affymetrix企业在20世纪80年代末到九十年代初率先开始研究。1991年，在1cm2左右玻璃片上原位合成寡核苷酸片段，诞生世界上首张寡核苷酸芯片。94年俄罗斯研制出一个基因芯片，用于检测β-地中海贫血病人血样基因突变，筛选了100多个β-地中海贫血已知基因突变。95年，第一块以玻璃为载体微矩阵cDNA微阵列在斯坦福大学P.O.Brown试验室诞生。生物芯片的研究与应用教学第10页生物芯片概念生物芯片是泛指利用微电子技术和微加工技术在硅，玻璃和高分子材料等基底材料上制作，用以执行生物样品分析，临床诊疗，环境监测，卫生检疫，法医判定，生化武器防御，新药开发等用途微型化精密器件。生物芯片借用了计算机芯片集成化特点，把生物活性大分子（当前主要是核酸和蛋白质）或细胞等，密集排列固定在固相载体上，形成微型检测器件，固相载体通常是硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜等，所以狭义生物芯片也称微阵列芯片，主要包含cDNA、寡核苷酸、蛋白质、细胞和组织微阵列。广义生物芯片是指能对生物成份或生物分子进行快速并行处理和分析厘米见方固体薄型器件，将微阵列技术与生物微机电技术相结合，经过微加工和微电子技术在固体基片表面构建微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其它生物组分准确、快速、大信息量检测。生物芯片的研究与应用教学第11页生物芯片特点在面积不大基片上有序地点阵排列了一系列固定于一定位置、可寻址和识别生物分子微电子学并行处理和高密度集成特点，可对生物分子进行快速并行处理高通量，高信息量、快速、自动化生物芯片的研究与应用教学第12页生物芯片与“组学”研究生物学过程是许多分子相互作用结果，需要知道“wholepicture”：组学特征；各种组学研究应运而生：基因组学，转录组学，蛋白组学，代谢组学，药品基因组学等等基因组序列可取得性计算机辅助可能性微电子学、物理学、化学、计算机科学与生命科学交叉综合高科技技术生物芯片在组学研究极具优势生物芯片的研究与应用教学第13页Source:GenBank

Thereareapproximately85,759,586,764basesin82,853,685sequencerecordsinthetraditionalGenBankdivisionsand108,635,736,141basesin27,439,206sequencerecordsintheWGSdivisionasofFebruary.GenBankbasepairgrowthgrowthofbiologicaldatabases生物芯片的研究与应用教学第14页growthofbiologicaldatabases3Dstructuresgrowth.../pdb/holdings.html生物芯片的研究与应用教学第15页FERN

160,000,000,000LUNGFISH

139,000,000,000SALAMANDER

81,300,000,000NEWT

20,600,000,000ONION 8,000,000,000GORILLA 3,523,200,000MOUSE 3,454,200,000

HUMAN 3,400,000,000 31,000Drosophila 137,000,000

13,500C.Elegans

96,000,000

19,000Yeast 12,000,000

6,315E.Coli 5,000,000

5,361genes基因组大小生物芯片的研究与应用教学第16页基因组学（genomics）基因组学就是发展和应用DNA制图、测序新技术以及计算机程序，结合各种生命科学研究伎俩，全方面分析生命体基因组结构及功效。基因组学分为两个阶段，即HGP、功效基因组学。HGP：制作高分辨率人类遗传图和物理图，最终完成人类和其它主要模式生物全部基因组DNA序列测定功效基因组学：详尽分析序列，描述基因组全部基因功效，包含研究基因表示及其调控，如比较基因组，药品基因组，基因多态性基因组，环境基因组学，蛋白组学等生物芯片的研究与应用教学第17页转录组学(transcriptomics)转录组就是指一个细胞内一套mRNA转录物。与基因组概念不一样，转录组定义中包含了时间和空间限定。同一细胞在不一样生长周期，在不一样生长条件下，其基因表示情况是不完全相同。生物芯片技术(DNA芯片、毛细管电泳芯片、PCR芯片)不但可用于DNA序列测定，更适合基因组或成千上万个基因表示分析，研究特殊阶段、环境、状态下细胞或组织在转录水平表示谱。生物芯片的研究与应用教学第18页药品基因组学(pharmacogenomics)1997年6月28日金赛特（巴黎）可伯特试验室宣告成立世界上第一个独特基因与制药企业，研究基因变异所致不一样疾病对药品不一样反应，并在此基础上研制出新药或新用药方法，这一新概念被称为药品基因组学，实现了基因功效学与分子药理学有机结合。基于基因组单核苷酸多态性（single-nucleotidepolymorphisms,SNPs）等遗传标志，以及基因表示。生物芯片的研究与应用教学第19页药品基因组学不以发觉基因为主要目标，而是相对简单地利用已知基因理论改进病人治疗。以药品效应及安全性为目标，研究各种基因突变/变异与药效及安全性关系。将DNA芯片技术应用于药品基因组学，进行基因功效及其多态性研究，以确认与药品效应及药品吸收、代谢、排泄等相关基因，并查明这些基因多态性，判定一系列全新药品效应基因（drug-responsegene）。生物芯片的研究与应用教学第20页药品基因组学药品效应基因所编码酶、受体、离子通道及基因本身作为药品作用靶，也是药品基因组学研究关键所在，是确定病人怎样产生药品疗效、疾病亚型分类依据、毒副作用基础。个性化治疗:有些人曾设计了一个急性原淋巴细胞白血病药品基因组芯片，这种芯片上包含了全部可能影响急性原淋巴细胞白血病病人对化学治疗反应基因，借助这种芯片能够依据病人基因型对病人分群，帮助医生为每个病人选择适当治疗药品和药品剂量。生物芯片的研究与应用教学第21页蛋白研究仅靠基因组序列远远不够说明生命现象。蛋白质本身存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质结构等问题，必须要依赖于对蛋白质组学研究来处理。任何一个疾病在表现出可觉察症状之前，就已经有一些蛋白质发生了改变。所以寻找各种疾病关键蛋白和标志蛋白，对于疾病诊疗、病理研究和药品筛选都含有主要意义。生物芯片的研究与应用教学第22页蛋白质组学(proteomics)蛋白质组研究一个机体，一个组织或一个细胞内全套蛋白质及其活动方式，相关技术有双相电泳，质谱和蛋白质芯片技术等。因为人有着大量组织、细胞类型和发育阶段，对人类蛋白组研究主要聚焦在特异组织、细胞和疾病上。几乎全部生理和病理过程，以及药品和环境因子作用都依赖于蛋白质，并引发蛋白质改变。反之，对蛋白质组改变分析也能提供对上述过程或结果主要信息。蛋白质组学主要包含：①细胞器蛋白质组学(Cell-mapproteomics)：即确定蛋白质在亚细胞结构中位置；经过纯化细胞器或用质谱仪判定蛋白质复合物组成等来确定。②表示蛋白质组学(Expressionproteomics)：把细胞、组织中全部蛋白质建立成定量表示图谱。生物芯片的研究与应用教学第23页蛋白质组学说明细胞代谢、信号传导和调控网络组织结构和动力学，并了解这些网络怎样在病理中失去功效，又怎样经过干预如药品和基因改变它们功效。说明一些疾病发生发展机理，并为处理路径提供理论依据。人各种体液(血液、淋巴、脊髓、乳汁和尿等)被用于研究与一些疾病关系。对于各种肿瘤组织与正常组织之间蛋白质谱差异研究，已经找到一些肿瘤特异性蛋白分子，可能会对揭示肿瘤发生机制有帮助。生物芯片的研究与应用教学第24页考查生物体系受刺激前后（如将某个特定基因变异或环境改变后）代谢产物图谱及其动态改变，来硕士物体系代谢网络。判定，检测如血液，尿液，唾液等中代谢物浓度和活性改变，研究对象主要是针对分子量1,000以下内源性小分子。代谢物种类远少于基因和蛋白数目；生物体液代谢物分析可反应机体系统生理和病理状态。基因和蛋白表示微小改变会在代谢物水平得到放大；药品代谢组学代谢组学metabolomics生物芯片的研究与应用教学第25页肝病代谢组学乙型肝炎造成肝硬化和肝癌问题突出；包含肝炎和肝癌在内肝脏疾病在代谢方面对局部和全身有影响肝脏作为人体内最大和最主要脏器负担了大部分合成、分解和转化等代谢过程，一些酶系和功效是肝脏所特有，所以必须从代谢角度对肝脏和肝病进行系统研究。同时，肝脏与其它脏器之间经过代谢交互作用（常见或未知小分子化合物）发生着各种联络。代谢组学不但能够将不一样肝病患者与正常人进行有效区分，而且能够在肝病早期经过代谢改变对疾病作出预警和发觉新病变标志物。生物芯片的研究与应用教学第26页组学“omics”生物芯片的研究与应用教学第27页Genome(DNA)Transcriptosome(RNA)Proteome(proteins)

interactome(pathways)生物芯片的研究与应用教学第28页比较基因组学(ComparativeGenomics)比较基因组学对已知基因和基因组结构进行比较，包括比较不一样物种整个基因组，来了解基因功效、表示机理和物种进化学科。利用模式生物基因组与人类基因组之间编码次序上和结构上同源性，克隆人类疾病基因，揭示基因功效和疾病分子机制，说明物种进化关系，及基因组内在结构。模式生物基因组普通比较小，但编码基因百分比较高，重复次序和非编码次序较少；DNA有一定冗余，即重复；其G+C%比较高；内含子和外显子结构组织比较保守，剪切位点在各种生物中一致；绝大多数关键生物功效由相当数量orthologous（直系同源蛋白）负担等生物芯片的研究与应用教学第29页系统生物学(systemsbiology)1997年，Arkin等经过测定糖酵解过程中不一样时间各个底物浓度改变，在不用已知知识情况下，经过计算重新创建了糖酵解路径，而生化学家用假说驱动花了几十年时间才建立糖酵解路径，这是系统生物学雏形正是提出系统生物学概念生物芯片的研究与应用教学第30页系统生物学NIH正式提出开启系统生物学研究，提出路线图计划（roadmap），拟经过这种组学研究结果建立理论模型，研究复杂生物网络，包含转录网络调控，代谢网络和信号传导网络等，最终揭示生命现象重大问题和重大疾病这些网络是否能处理生命本责问题还有待探索，不过能够大大加紧生物学研究步伐生物芯片的研究与应用教学第31页系统生物学将各个学科，各个层次生物知识综合对生物系统行为进行量化，预测。生物芯片的研究与应用教学第32页生物芯片系统优势一、比较组织间，疾病状态下不一样时间点基因表示差异二、对复杂疾病判定三、药品发觉和药品毒性测试四、病原微生物分析生物芯片的研究与应用教学第33页优势表达3月，日本佳能企业宣告进军医药市场，目标是实现DNA芯片批量生产。佳能称，企业将利用其在打印机方面采取喷墨技术，开发DNA芯片批量生产技术，目标是在20实现用于癌症、感染等疾病基因诊疗芯片产业化。年9月东芝，佳能和其它30至40个日本企业将联手开发生物芯片，希望在美国企业主导市场中寻求新收入。这些企业将携手合作，规范用于医学诊疗和食品安全检验生物芯片，预计20该市场在日本将增加到1000亿日元。几乎全部跨国制药企业都投入巨款利用基因芯片开展新药超高通量筛选和药理遗传学、药理基因组学等研究。生物芯片的研究与应用教学第34页疾病诊疗与治疗人类疾病与遗传基因亲密相关，基因芯片能够对遗传信息进行快速准确分析，用于分子诊疗是临床研究中一个新、强有力分子工具。遗传病相关基因定位肿瘤诊疗感染性疾病诊疗耐药菌株和药敏检测生物芯片的研究与应用教学第35页药品研究中应用新药开发。一个药品作用是多方面，基因芯片有利于发觉一个药品新功效。调查药品处理细胞后基因表示情况。该研究提醒，这类研究现有利于说明药品作用机制，也有利于确定药品作用靶基因，为新药研究提供线索。对药品进行毒性评价。用芯片作大规模表示研究往往可省略大量动物试验。若某个正在筛选潜在药品作用靶细胞得到基因表示图谱与已知含有毒性副作用药品得到基因表示图谱相同时，就要考虑是否停顿药品开发中花费巨大临床试验阶段。生物芯片的研究与应用教学第36页中医学领域中应用中药研究，详细方法，同药品筛选方法类似。中医“证”本质研究。中医理论包括到生命整体，因而它牵涉到许多基因和蛋白质，传统方法学无法搞清“证”实质，而利用基因芯片技术，对不一样“证”状态基因组进行扫描，绘出不一样证基因表示谱。针灸作用是与神经内分泌免疫网络系统亲密相关，但详细原理有待研究。针灸原理包括全身各个部分，经脉与脏腑间相关联络是否含有相对特异性长久争论不休。经过基因芯片研究针灸后不一样组织基因表示差异是否含有特异性，有望阐述这一问题。生物芯片的研究与应用教学第37页生物芯片系统缺点试验影响原因（不一样人得到不一样结果）：一、芯片和探针设计二、试验设计三、*样品准备四、图片取得五、数据均质化六、数据分析等生物芯片的研究与应用教学第38页生物芯片被动式芯片主动式芯片基因（DNA）芯片蛋白质芯片微流控芯片：样品制备芯片、聚合酶链反应（PCR）芯片、毛细管电泳芯片和色谱芯片cDNA芯片寡核苷酸芯片组织芯片细胞芯片芯片试验室：样品制备、试剂输送、生化反应、结果检测、信息处理和传递等一系列复杂工作生物芯片分类生物芯片的研究与应用教学第39页宏阵列与微阵列Macroarray多指点阵密集度较低尼龙膜基因阵列，因为膜本身表面张力原因，膜和上面每个点面积相对较大Microarray，在基因阵列上也通惯用DNAchip和GeneChip,多指点阵密集度很高玻片基质微阵列Macroarray膜芯片点样面积比现在玻璃芯片最少大十倍以上。即使点样面积小，不过microarray点阵密度可高出几百至几千倍。

生物芯片的研究与应用教学第40页微阵列microarray为了提升效率，就必须提升DNA片段点阵密度，即需要在一样大小支持物上固定更多DNA片段。借鉴集成电路制造技术，90年代光引导合成技术和DNA压电打印/喷引技术创造，以及激光共聚焦显微扫描技术引入，则直接造成了基因芯片诞生，也叫基因微矩阵通常biochip,Array,DNAarray和GeneArray能够泛指各种芯片上固定生物分子为核酸生物芯片。生物芯片的研究与应用教学第41页基因芯片将许多特定寡核苷酸片段或基因片段有规律地排列固定于支持物（如膜、硅片、陶瓷片及玻片）上，然后经过类似于Northern，Southern方法与待测标识样品按碱基配对原理进行杂交，再经过检测系统对其进行扫描，并用对应软件对信号进行比较和检测，得到所需大量信息，进行基因高通量、大规模、平行化、集约化信息处理和功效研究。生物芯片的研究与应用教学第42页基因芯片代表企业纵观生物芯片发展，基因芯片最先实现商品化而且当前技术最成熟美国Affymetrix企业是世界领先生物芯片供给商，GeneChip被注册专利，特指该企业产品系列新一代芯片技术光纤微珠芯片企业Illumina生物芯片的研究与应用教学第43页罗氏企业利用Affymetrix技术合作开发出P450基因分型芯片在日本，40%市场份额都由其占据；在我国，Affy和北京博奥生物芯片有限责任企业达成协议，共同开发先进、技术专有，并可兼容基因芯片系统平台基因芯片扫描仪以及建立基因芯片服务项目生物芯片的研究与应用教学第44页新一代芯片技术光纤微珠芯片ScreeningUnlabeledDNATargetswithRandomlyOrderedFiber-OpticGeneArrays,Steemers,F.J.,Ferguson,J.A.,Walt,D.R.,NatureBiotechnology,18,91-94,.Techview:MolecularBiology.Bead-BasedFiber-OpticArrays,Walt,D.R.,Science,287,451-452,DecodingRandomlyOrderedDNAArrays,KevinL.Gunderson,GenomeResearch,14:870-877,.Illumina生物芯片的研究与应用教学第45页当前面临困难样品制备上，当前多数企业在标识和测定前都要对样品进行一定程度扩增方便提升检测灵敏度探针合成与固定比较复杂，尤其是对于制作高密度探针阵列。目标分子标识也是一个主要限制步骤，目标分子与探针杂交会出现一些问题信号获取与分析上，要对如此大量信息进行解读，当前仍是一个艰巨技术问题。怎样检测低丰度表示基因仍是当前一个主要问题。生物芯片的研究与应用教学第46页基因芯片技术研究可能方向深入提升探针阵列集成度。提升检测灵敏度和特异性。高自动化、方法趋于标准化、简单化，成本降低。高稳定性。研制新应用芯片研制芯片新检测系统和分析软件，以充分利用生物信息。芯片技术将与其它技术结合使用，如基因芯片PCR、纳米芯片不一样生物芯片间综合应用，如蛋白质芯片与基因芯片间相互作用等，可用于了解蛋白质与基因间相互作用关系。生物芯片的研究与应用教学第47页DNAmicroarraydatamassivedatasetsfromsimultaneousexpressionlevelsof

thousandsofgenesimpossibletograspdirectlybythehumanmindmethodsareneededforfindingmeaningfulresultsand

patternsfromthebulkofdata生物芯片的研究与应用教学第48页Microarraydataanalysis生物芯片的研究与应用教学第49页microarraydataanalysisClusteringandpatterndetectionControlsandnormalizationofresultsDataminingandvisualizationStatisticalvalidationLinkagebetweengeneexpressiondataandgenesequence/function/metabolicpathwaysdatabasesDiscoveryofcommonsequencesinco-regulatedgenesMeta-studiesusingdatafrommultipleexperiments生物芯片的研究与应用教学第50页impactonbioinformaticsGenomicsproduceshigh-throughput,high-qualitydata,andbioinformaticsprovidestheanalysisandinterpretationofthesemassivedatasets.Itisimpossibletoseparategenomicslaboratorytechnologiesfromthecomputationaltoolsrequiredfordataanalysis.生物芯片的研究与应用教学第51页BioinformaticsisMultidisciplinaryComputerScienceMathStatisticsStructuralBiologyPhylogeneticsDrugDesignGenomicsMolecularBiologyinterdisciplinary生物芯片的研究与应用教学第52页蛋白芯片蛋白芯片是将大量蛋白质分子按预先设置排列固定于一个载体表面行成微阵列，依据蛋白质分子间特异性结合原理，以实现对生物分子准确、快速、大信息量检测。蛋白芯片反应结果检测要依据标识汇报分子种类来选择不一样检测设备。荧光标识是芯片信息采集中使用最多也是最成功汇报标志。杂交反应后芯片上各个反应点荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件能够进行分析，将荧光信号转换成数据，即能够取得相关生物信息。生物芯片的研究与应用教学第53页蛋白芯片原理生物芯片的研究与应用教学第54页蛋白芯片类型生物芯片的研究与应用教学第55页组织芯片（tissuemicroarray）1998年《NatureGenetics》首先报道组织微阵列（TMA）以形态学为基础高通量、多样本分析工具。它是将数十个甚至上千个微小组织片整齐排列在一张载玻片上而制成高通量组织切片，形成微阵列，将标识特定基因核酸探针或抗体探针与之杂交以检测该基因在不一样组织中表示情况。传统核酸原位杂交或免疫组化试验集成，核酸原位杂交或免疫组化一次检测一个基因在一个组织中表示，而组织芯片一次检测一个基因在各种组织中表示。生物芯片的研究与应用教学第56页组织芯片应用组织芯片与基因芯片或蛋白芯片也有所不一样，基因芯片或蛋白芯片一次能检测一个或两个样本中多个基因或蛋白质（反向杂交），而组织芯片恰好相反，一次检测多个样本中一个或两个基因或蛋白（正向杂交）。组织芯片技术能够与其它很多常规技术，如免疫组化、核酸原位杂交、荧光核酸原位杂交(FISH)、原位PCR等结合应用，所以尽管TMA最初只用于肿瘤研究，但它应用领域一直在不停地拓展。生物芯片的研究与应用教学第57页微流控芯片微流控是指在一个微小系统中对微量液体进行控制操作。最为人们熟知微流控技术应用是喷墨打印。结合生物技术、微电子、微机械等技术，将试验室中许多仪器功效缩小到芯片上来处理一个微型器件。借用微电子工业和其它加工工业中比较成熟微细加工工艺，如光学掩膜光刻技术、反应离子蚀刻、微注入浇铸和聚合膜浇注法等，在玻璃，塑料、硅片等基底材料上加工出用于生物样品分离或者反应微米尺寸微结构（如过滤器，反应室、微泵、微阀等微结构）。芯片试验室技术帮助用户快速高效地完成各种定性及定量生化分析，而手动操作极少。用于分析DNA、RNA、蛋白质和细胞。生物芯片的研究与应用教学第58页微流控芯片微流控芯片（第二代生物芯片）是微阵列芯片（第一代生物芯片）延伸微阵列芯片含有快速，高信息量优点，但至今广泛使用上仍受限制，除价格原因外，样品制备复杂繁琐是妨碍其广泛使用主要原因。微流控芯片，把前置处理过程微缩在芯片上，目标是把试验微型化，最终制成芯片试验室（lab-on-a-chip）有了它，就能够告别步骤繁复，仪器杂乱试验室。生物芯