成骨过程中骨髓基质干细胞与小肠黏膜下复合培养成骨及血管生成的研究

成骨过程中骨髓基质干细胞与小肠黏膜下复合培养成骨及血管生成的研究

骨缺损的恢复是临床上的难题之一。骨和骨膜移植存在于带区损伤和数量有限的缺点。异体骨移植可能会导致异体异体和感染疾病。利用组织工程技术构建组织工程化骨是修复骨缺损的趋势。但组织工程用的支架材料必须与细胞具有良好的生物相容性,包括表面相容性和结构相容性,才能有利于细胞的黏附、增殖和分化。同时还要有具有一定空隙和降解速度的三维结构,以利于营养物质和代谢产物的渗透交换,以及内皮细胞的黏附和新生血管的长入。小肠黏膜下层(smallintestinesubmucosa,SIS)是一种具有三维结构的细胞外基质材料,与骨膜的主要区别是不含具有成骨作用的成骨细胞。我们已证实SIS与骨髓基质干细胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCs)具有良好的组织相容性。但两者复合后的成骨及成骨过程的超微结构观察未见报道。我们将成骨诱导的BMSCs与SIS复合培养2周后构建仿生性组织工程骨膜,植入裸鼠皮下,从超微结构观察成骨过程中成骨细胞、血管生成的变化及体内成骨的过程,说明组织工程骨膜成骨的可靠性,为以SIS作为支架材料构建组织工程骨膜用以修复骨缺损提供实验依据。实验动物及设备主要仪器和试剂相差显微镜(Olympus),扫描电镜(QuanTa200,Philips-FEI),透射电镜(JEM-200CX),新生牛血清(杭州四季青生物制品公司),胰蛋白酶、地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠(Sigma),24孔培养板(上海普飞生物技术有限公司),裸鼠(上海市肿瘤研究所提供)。SIS制备1.小鼠的运输和去污小肠取自体质量至少200kg的封闭饲养的猪,小肠在运输过程中置于冰中,并且清洁过程在4h内完成,小肠的浆膜层和肌层用裹有纱布的刀柄去除,在去除黏膜和肌层过程中用40℃水持续冲洗。2.bmscs的制备和生长按Abraham方法制备。将用物理方法处理的小肠在室温下经过一系列的化学方法处理。材料与溶液的体积比保持在1∶100。①将物理方法制得的SIS浸泡在含有100mmol/L乙二胺四乙酸和10mmol/LNaOH溶液(pH11~12)中16h;②用去离子水将基质冲洗干净,在含有1mmol/LHCl和1mmol/LNaCl溶液(pH0~1)中浸泡6~8h;③用去离子水冲洗基质后,在含1mmol/LNaCl的磷酸缓冲液(phosphatebuffersolution,PBS)中浸泡16h;④用去离子水冲洗基质后,在PBS(pH7~7.4)中浸泡2h;⑤再用去离子水(pH5.8~7.0)冲洗基质2h;⑥杀菌:将SIS在含0.1%过氧乙酸的20%乙醇溶液中浸泡8h,用含0.05%叠氮化钠的PBS清洗2h,-70℃冻干后用γ射线(25~35kGy)照射消毒。BMSCs的分离和培养取2月龄普通级新西兰大白兔,体质量1.5~2.5kg,上海申旺养殖场提供,生产许可证号码:SCXK(沪)2002-0011。经耳缘静脉注射戊巴比妥钠(30mg/kg)全麻。胫骨上段及膝关节周围备皮,碘伏消毒皮肤,铺无菌手术巾,保持无菌状态。用小儿骨髓穿刺针接10mL注射器,注射器内含稀释的肝素钠2500U/mL,加入2mLPBS混匀。自胫骨上段前内侧穿刺抽取骨髓4mL,缓慢注入预先加入4mL淋巴细胞分层液的离心试管中,密度梯度离心(2000×g)20min,吸取单核细胞层,用D-Hanks液洗涤离心(1000×g)2次,每次10min。按1×105/mL的密度接种于培养皿中,加10%胎牛血清DMEM培养液5mL(其中含有青霉素100U/mL,链霉素100U/mL,pH7.2~7.4),在37℃、5%CO2孵箱中培养4d,更换培养液,将未贴壁细胞弃掉。继续培养,每隔3~4d更换1次培养液。相差显微镜下观察,见细胞大部分长满贴壁后,用0.25%胰蛋白酶消化5min后传代培养。BMSCs与SIS体外复合培养将传至第三代、在完全培养基中加入成骨诱导剂(β-甘油酸钠80μg/mL、地塞米松10mmol/mL、L-抗坏血酸80μg/mL)培养的BMSCs以5.0×105/孔的密度接种于24孔培养板,每孔加1cm×1cmSIS材料1块,再加入培养基1mL,于37℃、5%CO2饱和湿度条件下复合培养,每3天更换1次培养液。1、2周后取出SIS用于观察及检测。另设6个空白对照,材料上不种植细胞。超微结构观察①扫描电镜观察:BMSCs与SIS复合培养第1、2周后,将培养孔内生物材料取出,2.5%戊二醛固定,系列丙酮中脱水,乙酸异戊酯置换,临界点干燥,表面喷金后扫描电镜观察BMSCs在SIS上的附着、生长、分裂和增殖情况。②透射电镜观察:BMSCs与SIS复合培养1、2、4周及植入裸鼠体内4、8、12周后,2.5%戊二醛固定,系列丙酮中脱水,浸透及环氧树酯包埋,超薄切片机切片,醋酸铀-柠檬酸铅双染色,透射电镜观察BMSCs中的细胞器变化情况。bmscs的生长扫描电镜观察体外复合培养时,培养7d细胞数量明显增多,细胞分泌旺盛,细胞间有大量胶原纤维丝形成细胞间连接。部分细胞跨越孔隙,呈长梭形,有的正在分裂,有的重叠生长(图1A)。培养10d后细胞数量增多,连成一片。2周时细胞数量增加更多,细胞分裂、增殖呈三维生长,细胞分泌大量细胞外基质,呈蜂窝状,缝隙逐渐被细胞外基质填塞而变得致密,细胞轮廓也变得模糊(图1B)。透射电镜观察体外培养时BMSCs在SIS上呈多层生长,细胞连接紧密。胞体成梭形,膜表面有微绒毛状突起,细胞核呈梭形或不规则形,偶见有分叶形,粗面内质网丰富、扩张、增粗,细胞间基质致密,可见钙化灶形成(图1C)。复合材料植入体内4周时,见有大量成软骨细胞和成骨细胞,细胞核较大,细胞内有大量线粒体。以围绕新形成小血管的成骨细胞最为典型,细胞核较大,胞浆内含扩张的粗面内质网和高尔基体,细胞分泌大量的细胞外基质,间质中有部分钙化带形成(图2A)。此时形成的小血管管周内皮细胞包绕不完整,称为血管芽。复合材料植入体内8周时,中央部分骨细胞数量减少,包埋于成熟的细胞外基质中。血管内皮细胞变为扁平并包绕整个血管腔,成骨细胞周围已含有大量骨基质(图2B)。12周时,成骨细胞仍存在,但数量明显减少,胞浆中细胞器退化,包埋于成熟的细胞外基质中,有大量的钙盐沉积带(图2C)。单纯SIS植入体内8周,见有血管、成纤维细胞和巨噬细胞形成,未见成骨细胞及成熟骨形成(图3)。sis与bmscs的作用机制组织工程化组织是细胞与材料的复合体,本身无营养来源,营养物质和氧气的供应主要依赖渗透和扩散作用。体积大于几毫米就不能依靠营养的弥散而生存,必须通过血管再生来获得营养。组织工程骨的血管再生与支架材料的种类和性质密切相关,选择支架时应考虑与血管内皮细胞生长及毛细血管形成相协调的材料,支架必须具有一定的孔隙和降解速度以利于血管长入内部。SIS是从猪空肠黏膜下层分离出的无细胞胶原层,是天然细胞外基质类材料,作为可吸收支架和基质材料已广泛应用于多种组织的修复。SIS这种生物材料更接近于天然结缔组织复杂的成分结构,其结构与细胞更具亲和力,有良好的细胞相容性,并且含有血管内皮细胞生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子-2、转化生长因子-β等多种生长因子。当SIS植入宿主体内后,能迅速诱导细胞浸润,刺激血管生成和宿主细胞的长入、分化。产生的再生组织在结构和功能上与原有组织相似,能为宿主细胞提供可吸收支架材料,基本能满足对生物支架材料的要求,最终达到修复组织缺损的目的。SIS含有超过90%的Ⅰ型和Ⅲ型胶原。Ⅰ型胶原是骨有机质的主要成分,在体内为钙盐的沉积提供支架。同时体外实验中,Ⅰ型胶原可促进BMSCs向成骨细胞诱导分化。胶原有利于细胞黏附和早期血管的长入,并且可吸附血液中的生长因子。BMSCs具有来源广泛、对机体的损伤小、分离方便、增殖快、能多向分化的优点,已经成为骨组织工程研究中的最佳种子细胞。本研究通过扫描电镜和透射电镜观察SIS复合培养BMSCs,不同时期体内成骨的变化过程,发现应用SIS与BMSCs复合培养2周后,将细胞-材料复合体植入裸鼠皮下,在材料内形成大量的骨基质,并可见大量血管长入。成骨细胞总是毗邻血管内皮细胞而存在,并随着微血管的增生而逐渐向骨细胞发展,最后完全包埋于成熟骨基质中。而植入单纯SIS材料的对照组,中心部位虽然也有血管生长,但始终无成骨细胞及成熟骨基质出现,也未见成骨细胞与血管内皮细胞的毗邻与依附关系,从超微结构上证实了SIS更有利于血管内皮细胞的生长,植入物的早期血管化促进了新骨形成。成骨细胞与血管内皮细胞的关系可能与VEGF介导有关。Kaigler等证明BMSCs在体外可分泌足量的VEGF而促近BMSCs的生长与分化,同时也发现BMSCs在体内可直接调节血管生成。VEGF可刺激血管内皮细胞的增殖与迁徙,并可增加血管的通透性,使许多血浆蛋白渗出血管外,这对改造局部的细胞外基质以适应血