生物制品制造新技术

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第一节基因工程疫苗

基因工程疫苗主要是指用重组DNA技术研制的疫苗，包括将保护性抗原基因在原核或真核载体细胞中的重组亚单位疫苗，以及以某些病毒或细菌为外源基因载体的活载体疫苗和通过基因组突变、缺失或插入的基因缺失疫苗，以及重组DNA疫苗等。疫苗分类

活疫苗经典策略--病毒重组病毒重组病毒载体经典策略--细菌重组细菌重组细菌载体

死疫苗完整病原体疫苗蛋白基础疫苗肽基础疫苗多糖基础疫苗抗独特型疫苗

DNA疫苗

“Naked”DNAViraldeliveryBacterialdelivery根据疫苗抗原的性质和制备工艺

经典策略活疫苗在细胞上培养减毒分离异源变异病毒株ResortedGenomes筛选温度敏感突变株死疫苗1.

完整病原体疫苗（细菌、病毒）2.蛋白基础疫苗(Protein-basedVaccine)

天然蛋白化学灭活蛋白基因灭活(重组突变)

重组多肽(HBsAg,VLPsofpapillomavirus)Carrier(酵母Ty颗粒)

3.多糖基础疫苗4.抗独特型抗体

活疫苗可在宿主细胞中复制毒力降低免疫反应比较全面免疫剂量小免疫保护期长

死疫苗

不能在宿主细胞中复制

无毒，不返强免疫反应不太全面

不会传染给其它个体

制备技术相对容易DNA疫苗

可刺接抗原在细胞内合成可诱导细胞免疫制备技术容易标准化

不同疫苗特性比较重组疫苗（基因缺失疫苗）重组载活体疫苗重组亚单位疫苗转基因植物疫苗基因疫苗

基因工程疫苗种类“标记”疫苗

基因添加疫苗

疫苗：

●重组亚单位疫苗：将病毒或细菌的主要保护性抗原基因在体外大量表达

●活载体疫苗：病毒或细菌载体+外源基因

●基因缺失苗：删除毒力相关，但对病原复制非必需的基因

●DNA疫苗（肿瘤疫苗）：质粒+真核启动子+外源基因

●合成肽疫苗：人工合成保护性抗原蛋白的部分肽段●转基因植物可食疫苗：利用植物表达病原的保护性抗原蛋白抗原：重组抗原、核酸探针、基因芯片技术、PCR技术,抗体：基因工程抗体制造技术，如生物导弹（可以治疗肿瘤）、将抗体基因与毒素基因连接后进行表达。遗传信息的传递和表达中心法则

基本概念1.基因工程载体目的外源基因分离后是无法自主进入到宿主细胞并进行复制表达的,必须有一运载工具将其运达宿主细胞才能复制、扩增、传代和表达.这种将外源目的基因带入宿主细胞并与其一起复制、表达的基因运载工具就叫做基因载体或基因工程载体.本质上所有基因载体都是DNA.外源基因都是插入到载体DNA的序列中，然后随载体进入宿主细胞，并随载体的复制而复制或表达.2.质粒质粒是细菌质粒(Plasmid)是指细菌细胞质中独立于染色体外的、能够自主复制的遗传单位，是环状双链DAN小分子,它能够随着细胞的增殖而稳定地遗传给子代细胞。质粒的复制和转录依赖于宿主细胞所编码的蛋白质和酶，是胞质复制子。质粒不是细菌生长、繁殖所必须的结构。质粒对宿主细胞没有干扰，此不同于病毒和噬菌体.质粒的复制与染色体是同步的，而且其拷贝数是恒定的，分配给每个子细胞的质粒拷贝数也是相同的.重组亚单位疫苗概念：将病原的主要保护性抗原蛋白基因在体外进行大量表达，纯化其表达产物辅以佐剂制成疫苗----亚单位疫苗。特点：利用体外表达系统（如大肠杆菌，杆状病毒，酵母等）大量表达病毒的主要保护性抗原蛋白作为亚单位疫苗不仅具有良好的安全性和稳定性，而且便于规模化生产。利用非疫苗用蛋白作为抗原建立的诊断方法将可以区分亚单位疫苗免疫的动物和自然感染的动物。

适用于发病快，病程急，中和抗体能有效控制发病的传染病。如：猪瘟，高致病力禽流感，新城疫，传染性法氏囊病等。

不适于病程发展缓慢，潜伏期长，感染巨噬细胞且有ADE效应的疾病。如：人类爱滋病，动物慢病毒病（马传贫，山羊关节炎脑炎等），动脉炎科病毒（猪繁殖与呼吸综合征等）。重组亚单位疫苗构建流程保护性抗原的基因原核或真核表达载体原核或真核细胞保护性抗原肽链重组亚单位疫苗佐剂用含EcoRI和NotI酶切位点的引物扩增PoIFN-α基因，并将其克隆入pGEM-TEasy载体中

EcoRINotI

EcoRINotIEcoRI和NotI双酶切

EcoRI和NotI双酶切

亚克隆T4连接酶连接

图原核表达载体pGEXIFN-α重组路线图

重组质粒pGEM-T-IFN-αZEcoRI和PstI双酶

EcoRI和PstI双酶

T4连接酶连接

亚克隆PstIEcoRIEcoRIPstI图原核表达载体pETIFN-α重组路线图重组活疫苗（recombinantlivevaccine）

通过基因工程技术，将病原微生物致病性基因进行修饰、突变或缺失，从而获得弱毒株，研制成疫苗。重组病毒构建原理1.同源重组法2.从cDNA克隆拯救感染性病毒野病毒基因弱毒病毒基因非毒力基因鉴定克隆该关键基因至质粒将该关键基因与野毒株基因结合稳定低毒力基因

重组病毒构建原理（I)基因缺失疫苗概念：将病原体的某个或某些基因（复制非必需的，或与毒力相关的）全部或部分删除，使其毒力下降，但仍然保留一定的复制能力。特点：缺失与毒力相关基因及病毒复制非必需的基因是发展活疫苗的理想途径之一。由于毒力相关基因的缺失导致病毒致病力的减弱，但仍然保持其良好的免疫原性。这种基因缺失的病毒作为疫苗的突出优点是不易返祖而重新获得毒力。缺失的基因可作为一种遗传标志用于建立鉴别诊断方法。。实例：伪狂犬病毒基因缺失标记疫苗，牛传染性鼻气管炎病毒基因缺失标记疫苗，Nef基因缺失的猴免疫缺陷病毒，Vif基因缺失的猫免疫缺陷病毒，P39基因缺失的布氏杆菌疫苗，R3/G4基因缺失的牛白血病病毒，……纯化PRV提取PRV基因组技术路线经sph1、kpn1酶切含gG、gD、gE基因PUC18载体质粒PUSK质粒PAcGFP-C1重组质粒PUSGPRV基因组重组基因缺失病毒常被缺失基因：胸腺激酶基因(TK)

痘苗病毒TK基因缺失单纯疱疹病毒(HSV)的22毒力基因缺失、TK基因缺失牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)TK基因缺失疫苗缺点是疫苗病毒具有潜伏性伪狂犬病病毒TK基因缺失苗

1986年获美国农业部批准投放市场缺失非必需基因目前投入使用的PRV缺失疫苗从cDNA克隆拯救感染性病毒

病毒全长感染性cDNA克隆技术反向遗传操作技术(ReverseGenetics)“病毒拯救(rescueofvirus)

重组病毒构建原理（II)“分段克隆”策略：将病毒基因组各片段顺次克隆。低拷贝载体：复制严谨性较高沉默突变：在构建cDNA克隆时，一般均在一处或几处合适的位置上进行沉默突变，便于鉴定拯救出的病毒。基因组3’末端和5’末端的克隆采用cDNA末端快速扩增法(RACE)

基因组全长片段的克隆Menlenbarg等（2000，2003）

NSPGP2GP3GP4GP5MN

FMDV蛋白酶2A基因

人A型流感病毒HA基因抗原表位

感染性cDNA克隆举例

mRNABHK21细胞病毒子接点插入位点PRRSVInfectiousPRRSVProgeny

感染性子代病毒PRRSVInfectiousClone(ReverseGenetics)PRRSVGenomicRNAGenome-lengthcDNAInfectiousRNAtranscriptRT/PCRPRRSVVirions病毒粒CELL基因组RNA全长cDNA感染性RNA拷贝pFL12

19,195bpF10PRRSVcDNAAclIBsrGI3’5’1a1b234567AnABDBsu36IXbaIBsrGlBsrGI5C3CF10An

InfectiouscDNACloneofaHighlyPathogenicStrainofPRRSV:InVivoStudies高致病性PRRSV感染性cDNA克隆：体内研究HaM.Truong,JudithGaleota,FernandoA.Osorio,AsitK.PattnaikGeneticChimerasbetweenTwoStrainsofPRRSVDONORRECIPIENTpFL12(19,231bp)ORF1a246ORF1b357pFL12virulentinfectiousclone5’An3’ORF1b357ORF1a246Attenuatedvaccinestrain(PrimePac,Hesseetal.,AASP1996:103)5’UTR.NSP1.2NSP2.3NSP3.8NSP9NSP9.12NSP12.ORF3ORF3.3’UTRORF2.3’UTRC1C2C3C4C5C6C7C67NDV--微型基因组的构建与共转染启动子病毒基因组片段病毒前导序列尾随序列辅助重组质粒NP、P和L蛋白共转染微型基因组流感病毒:NP、PB1、PB2、PA

PB2PB1PAHANANPMNSPB2PB1PAHANANPMNSPB2PB1PAHANANPMNSAttenuatedDonorMasterStrainNewVirulentAntigenicVariantStrainXAttenuatedVaccineStrain:CoatofVirulentstrainwithVirulenceCharacteristicsofAttenuatedStrain活载体疫苗概念：利用低致病力的痘病毒、疱疹病毒、腺病毒或细菌作为载体，将其它病原的主要保护性抗原基因插入到载体基因组的非必需区形成新的重组体，在同源或兼容性好的启动子驱动下随载体的复制表达插入的外源基因。特点：此疫苗具有常规疫苗的所有优点，而且便于构建多价疫苗，建立鉴别诊断方法。但成功的关键取决于外源基因的表达水平，此类疫苗不能进行二次免疫。实例：痘苗病毒+狂犬病毒G蛋白基因，鸡痘病毒+多种其它禽病原基因，伪狂犬病毒+其它猪病原基因，……病毒复制非必需片段基因鉴定病毒复制非必需片段基因克隆外源基因插入非必需片段基因中间(即重组载体)将病毒基因和重组载体基因共转染至细胞，同源重组，产生感染性病毒粒子筛选稳定的重组病毒重组病毒活载体研制原理复制非必需基因