细菌耐药表型的检测

细菌耐药表型的检测（一）1.葡萄球菌1.1对B-内酰胺类药物耐药机制葡萄球菌对B-内酰胺类药物的耐药至少有三种不同的机制。①产生添加的青霉素结合蛋白PBP2a；②大量产生灭活药物的B-内酰胺酶；③内源性的PBP被修饰（modifiedintrinsicPBPs,MOD-SA）降低了与药物的亲和力°PBP2a由mecA基因编码，这个基因可能源自枯草杆菌，它所编码的PBP2a不但不与B-内酰胺类药物结合，而且能替代几种PBPs的功能，在细胞壁的合成中发挥转肽酶作用。带有mecA基因的菌株可以是同质性的，在体外药敏试验中均表现耐药；也可以是异质性的，在体外试验中仅1/104-108个菌表现耐药。大量产生B-内酰胺酶引起的耐药，是由于酶打开药物中的B-内酰胺环，使药物失去了与靶位（PBP）结合的能力，也称做药物被灭活oMOD-SA型耐药是由于葡萄球菌原有的PBP1、2、4被修饰后降低了B-内酰胺类药物的亲和力。表13-1耐B-内酰胺类药物的葡萄球菌的苯唑西林表型分类苯唑西林mecA基因机制borderlinea耐药抑制剂作用B-内酰胺类交叉耐药其它药物交叉耐药R（同质性）+PBP2a--++R（异质性）+PBP2a土-++S-产生B-内酰胺酶增加++--R/S-PBP1、2、4被修饰+---a：borderline耐药表型：稀释法中，苯唑西林MIC在2-8ug/ml之间，无明确终点；扩散法抑菌圈直径10-13mm,边缘不整齐。b：表示可以有例外情况实验室检测B-内酰胺酶检测采用酸法、碘法和头抱噻吩（nitrocefin）法3种方法任一种均可。苯唑西林耐药性检测NCCLS推荐用琼脂筛选法。我们的具体方法是配制含40g/LNaCl的MH琼脂（加水量为应加量的9/10）,高压灭菌后分装试管每管9ml,加盖无菌橡皮胶塞后4°C保存。配制60pg/ml苯唑西林贮存液过滤除菌后分装，每管1ml,-20°C保存（冰箱结冰室-18C左右亦可）半年内有效。临床用前将MH琼脂隔水煮沸溶化，冷至50C以下，先将苯唑西林贮存液加入70mm直径的平皿，再倒入MH琼脂轻晃摇匀。将待测的金黄色葡萄球菌，调至0.5麦氏单位，点种琼脂后30C〜35°C（不可超过35C）孵育24小时，有任何生长现象即为耐药。本法目前只适用金黄色葡萄球菌。纸片扩散法检测苯唑西林的耐药性，方法同常规方法基本相同。不同处为:MH琼脂中NaCl浓度为40g/L，金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径判断标准三13mm为敏感，11〜13mm为中介，W10mm为耐药；凝固酶阴性的葡萄球菌：218mm为敏感，W17mm为耐药，注意要将平皿对着光线检查抑菌圈内是否有菌落生长。稀释法也是在MH中加入40g/LNaCl，金黄色葡萄球菌：MICW2pg/ml为敏感，24pg/ml为耐药；凝固酶阴性的葡萄球菌，MICW0.25pg/ml为敏感，三0.5pg/ml为耐药。1.1.3试验药物的选择和预报性在常规工作中，葡萄球菌对B-内酰胺类药物的药敏试验，可以只检测青霉素、苯唑西林和氨苄西林/舒巴坦来判断，如果能用硝噻吩法检测快速P-内酰胺酶最好。青霉素敏感的菌株表示对所有不耐酶的青霉素类药物如氨苄西林、阿莫西林、羧苄西林、哌拉西林、替卡西林等均敏感，B-内酰胺酶阳性或青霉素耐药、氨苄西林/舒巴坦和苯唑西林敏感，表示对耐酶青霉素类药物或青霉素类/酶抑制剂的复合制剂敏感。苯唑西林耐药的葡萄球菌即目前被称为MRS(耐甲氧西林的葡萄球菌)菌株，这种耐药类型的细菌表示对所有的3-内酰胺类药物包括青霉素类、头抱菌素类、3-内酰胺类/酶抑制剂复合制剂、卡巴配能类均耐药。而这些药物在体外试验中可显示有活性，如果被误报给临床，可能会误导临床用药。同时苯唑西林耐药的葡萄球菌常常对红霉素、氯林可霉素、氯霉素、四环素、复方新诺明、旧喹诺酮或氨基糖苷类耐药。此外，苯唑西林敏感，而上述抗菌药物出现较多交叉耐药的菌株，也要考虑MOD-SA型的耐药，提示临床慎用表型为3-内酰胺类敏感的药物。对氨基糖苷类药物耐药机制细菌可以产生多种酶灭活氨基糖苷类药物，这种灭活作用非常复杂，它们主要分为三大类：乙酰转移酶(AAC)、核苷转移酶(ANC)和磷酸转移酶(APH)。每一类酶中又有许多亚类可以修饰不同位置上的羟基或氨基，导致不同的耐药表型，在葡萄球菌中(也发现在肠球菌中)最重要的是aac(6')-Ie基因，编码产生双功能酶AAC(6')加APH(2”)。其APH(2”)部分可以修饰庆大霉素、妥布霉素和卡那霉素，AAC(6')部分可以修饰妥布霉素、奈替米星、卡那霉素和阿米卡星。因此这种双功能酶实际使细菌对除链霉素以外的所有氨基糖苷类药物耐药。有些酶能催化修饰不同的氨基糖苷类药物，但是由于酶对不同底物(药物)的米氏常数(Km)不同，其催化效率的高低使试验结果显现不同的表型。如APH(3')-III可以修饰卡那霉素、奈替米星和阿米卡星，但在常规药敏试验中却表现为对阿米卡星敏感，显现错误的表型，除了产生灭活酶外，在金黄色葡萄球菌中也发现由于核糖体被修饰后导致的对链霉素的耐药。(同肠球菌详见本章2.2.1节。实验室检测及预报性对氨基糖苷类的耐药性最好检测其耐药酶。临床可用的氨基糖苷类药物虽然并不多，但酶的种类、亚类却非常之多，因而只能在少量参考实验室进行此项工作。目前我们只能根据常规药敏试验中的某些表现推测其可能存在的耐药机制，修改实验室结果，预测临床疗效。下表列举了最常见的几种情况。表13-2葡萄球菌对氨基糖苷类药物的耐药预测表型推论机制预测耐药KmRTmSGmSAkSAPH(3')KmRTmSGmSAKI/RKmRTmRGmSAkSANT(4')KmRTmRGmSAkI/RGmRAPH(2”)AAC(6')所有氨基糖苷类R(除链霉素外)Km:卡那霉素 Tm:妥布霉素Gm:庆大霉素AK:阿米卡星R：耐药 I：中介 S：敏感1.3对糖肽类药物已经有人报道分离到对万古霉素中等水平耐药的葡萄球菌，这种耐药的机制还不清楚，这些分离株的耐药性并非从肠球菌中获得对万古霉素的耐药基因所导致。但是已经在实验室条件下，应用接合的方式将粪肠球菌对糖肽类药物的高水平耐药转移给金黄色葡萄球菌，采用纸片扩散法检测葡萄球菌对万古霉素的耐药，抑菌环直径三15mm为敏感，W14mm的菌株应该测MIC,当检验到万古霉素耐药的葡萄球菌时，应重新鉴定细菌和重复药敏试验，并送参考实验室确认。1.4对喹诺酮类药物喹诺酮类药物作用于细菌的DNA回旋酶（II型拓扑异构酶）和IV型拓扑异构酶，阻断了细菌的生长和分裂，起到杀菌作用。当编码DNA回旋酶的gyrA基因和编码IV型拓扑异构酶的parC基因发生突变时，细菌产生耐药。细菌细胞膜通透性改变也可引发耐药，这种耐药通常伴有对结构不相关药物的耐药，葡萄球菌对喹诺酮的耐药往往是parC基因的突变，这种耐药表型为对环丙沙星的耐药。在葡萄球菌的药敏试验中，如果环丙沙星耐药，可预测氧氟沙星，左旋氧氟沙星耐药。细菌耐药表型的检测（二）2肠球菌2.1对B-内酰胺类药物的耐药耐药机制肠球菌对B-内酰胺类药物的耐药可以是青霉素结合蛋白的改变，也可以是产生邛-内酰胺酶。肠球菌自身的青霉素结合蛋白（PBPs）与8-内酰胺类药物的亲和力较低，青霉素对肠球菌的MIC通常三2pg/ml,而对链球菌的MIC通常W0.12pg/ml。肠球菌的这种天性，表现为对B-内酰胺类药物的“相对耐药”而肠球菌对青霉素和氨苄西林的耐药（MIC216pg/ml），是因为PBPs发生了改变，使亲和力进一步降低。这种耐药性屎肠球菌（MIC16〜32pg/ml）比粪肠球菌（MIC2〜4pg/ml）更为突出。p-内酰胺酶形式的耐药在肠球菌中非常少见，目前仅在粪肠球菌中发现产B-内酰胺酶的菌株。实验室检测采用常规纸片扩散法或稀释法（肉汤稀释法或琼脂稀释法）能检测PBPs改变引起的耐药，不能检测产生p-内酰胺酶引起的耐药。稀释法中要注意菌液浓度为107CFU/ml,比通常稀释法中的菌液浓度高100倍。p-内酰胺酶的检测推荐使用头孢硝噻吩法（见1.1.2节）。试验药物的选择及其预报性仅P-内酰胺酶阳性的肠球菌，预示对青霉素、氨苄西林、哌拉西林耐药，而对泰能、P-内酰胺类加酶抑制剂的复合药物敏感。目前仅见到粪肠球菌P-内酰胺酶阳性报导。血和脑脊液中分离的肠球菌检测P-内酰胺酶，可以尽早指导临床用药。p-内酰胺类药物中选择青霉素和氨苄西林进行药敏试验即可。p-内酰胺酶阴性、青霉素敏感的菌株对氨苄西林、阿莫西林、哌拉西林以及他们与酶抑制剂的复合制剂敏感。p-内酰胺酶阴性、氨苄西林敏感的菌株预示对氨苄西林/克拉维酸以及阿莫西林/舒巴坦敏感。所谓对青霉素和氨苄西林“敏感”的分类，意味着对严重的肠球菌感染需要大剂量药物治疗。青霉素、氨苄西林耐药的菌株，一般认为是PBPs改变，泰能即使敏感也应考虑耐药。由肠球菌引起全身性严重感染（如心内膜炎等），如果对高浓度氨基糖甙类敏感，而氨苄西林耐药，应该检测氨苄西林的MIC,如果氨苄西林的MIC16〜64ug/m1,仍可以考虑与氨基糖甙类联合用药（详见下一节）。头孢菌素类药物不宜选择进行肠球菌的药敏试验，因为其可以表现为体外试验敏感，而临床无效。对氨基糖甙类高水平耐药耐药机制一般不选用氨基糖甙类单一药物治疗肠球菌感染,因为氨基糖甙类药物不易被摄入肠球菌，表现为内源性、中等水平耐药，MIC通常在8〜256pg/ml。当与作用于细胞壁的药物如青霉素、氨苄西林、万古霉素等联合用药,通过损伤细菌细胞壁,使氨基糖甙类药物进入菌体，与细菌30S核糖体亚单位结合，干扰蛋白质合成，发挥杀菌作用。一旦出现对氨基糖甙类高水平耐药（庆大霉素的MIC2500pg/ml,链霉素21000》g/ml）,说明产生获得性的耐药。此时，对链霉素的耐药是编码细菌核糖体的基因发生了突变，由于靶位的改变药物不能结合到作用部位，引起耐药；对其它氨基糖甙类药物的耐药是获得了新的基因，编码产生修饰药物的酶，使药物灭活。实验室检测庆大霉素纸片含药量120pg/片，链霉素纸片含药量300pg/片，在MH琼脂上进行KB法药敏试验，两种药物的判定界点一样，即直径210mm为敏感，7〜9mm为中介，W6mm为耐药。如果所测抑菌圈直径为7-9mm,表示试验无法定论，应使用琼脂筛选法或肉汤筛选法确定耐药性。方法是配制庆大霉素含量500pg/ml的BHI肉汤或琼脂，链霉素含量1000Mg/ml的BHI肉汤或2000pg/ml的BHI琼脂，肉汤法的接种菌量如标准肉汤稀释法，琼脂法接种菌量为0.5麦氏单位10ul菌液。35°C孵育，庆大霉素24h,链霉素24〜48h（24h敏感继续孵育至48h，出现生长现象（琼脂法＞1个菌落）即为耐药。质控菌株有粪肠球菌ATCC29212（敏感株）和ATCC51299（耐药株）。试验药物的选择及其预报性在氨基糖苷类药物中，肠球菌一般仅进行庆大霉素和链霉素高浓度药敏试验即可，其它氨基糖苷类的药敏试验，因为庆大霉素和链霉素对肠球菌的活性较同类其它药物高。高浓度的庆大霉素或链霉素敏感预示着可以和作用于细胞壁的、药敏结果敏感的青霉素类或糖肽类药物（如氨苄西林、青霉素、万古霉素等）协同用药，高浓度的庆大霉素或链霉素耐药，预示不可协同用药。对糖肽药物的耐药耐药机制肠球菌对糖肽类药物的耐药机制正被广泛研究。对人类致病的肠球菌，对糖肽类药物（万古霉素、替考拉宁）的耐药主要有VanA和VanB两种表型，VanA型耐药表现为对万古霉素（MIC264Mg/ml）和替考拉宁（MIC216pg/ml）诱导型高水平的耐药，但并不代表对其它抑制细胞壁合成的药物耐药。编码VanA的基因携带在11Kb的转座子Tn1546上，可以通过接合的方式在肠球菌间传播高水平耐药。在实验室条件下，已成功地通过接合的方式将粪肠球菌对糖肽类药物的耐药转移到金黄色葡萄球菌中。VanB型耐药对万古霉素呈现低至高水平耐药（MIC16〜512mg/ml）,通常对替考拉宁敏感。实验室检测可以采用纸片扩散法、稀释法和筛选法检测耐万古霉素的肠球菌，前二种方法实验操作同NCCL规定的一般细菌药敏试验检测方法，扩散法中万古霉素纸片为30pg/片，直径三17mm为敏感，15〜16mm为中介，W14mm为耐药。替考拉宁纸片为30pg/片，直径三14mm为敏感，11〜13mm为中介，W10mm为耐药。要注意测试万古霉素的活性时，应孵育24h,并用透射光检查。在抑菌圈内出现薄雾状或其它生长现象均表示耐药。中介值的菌株要用稀释法重新检测。筛选法检测万古霉素耐药的方法是：BHI琼脂高压灭菌后，冷至50°C以下，加入终浓度为6pg/ml的万古霉素，倾注平板。然后在琼脂表面点种0.5麦氏单位的菌液1〜10p1，35C24h，生长＞1个菌落即为耐药，质控菌株有粪肠球菌ATCC29212（敏感株）和ATCC51299（耐药株）。检测到万古霉素耐药的肠球菌，应注意细菌的鉴定是否准确，药敏试验中所用细菌是否为纯菌，并最好重复测试一次。耐万古霉素的肠球菌，不能用万古霉素与氨基糖苷类药物协同用药，由于可选择的药物有限，可以加测氯霉素、红霉素、四环素（或多西环素或米诺环素）以及利福平的敏感性，最好向有经验的传染病专家咨询治疗方案。3.肺炎链球菌肺炎链球菌对青霉素的耐药是因为青霉素结合蛋白的突变或多种PBP同时改变，如PBP2b、PBP2x、PBP1a。在B-内酰胺类药物中，只有苯唑西林可用纸片法检测，其它p-内酰胺药物均无可靠的纸片扩散法药敏试验，它们的体外活性最好用稀释法，苯唑西林的纸片扩散法用含5%羊血的MH琼脂，1pg/片苯唑西林纸片，余同K-B纸片扩散法，抑菌圈220mm的菌株，报告青霉素敏感，并可以认为对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、头孢克洛、头孢地尼、头孢吡肟、头孢他美、头孢克肟、头孢噻肟、头孢丙烯、头孢布烯、头孢三嗪、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南敏感，不需再做这些药物的检测。如苯唑西林抑菌圈W19mm,不能报告青霉素中介或耐药，需要检测青霉素和头抱噻肟或头抱三嗪的MIC。从重要感染部位如脑脊液、血液中分离肺炎链球菌要常规检测青霉素和头孢噻肟或头孢三嗪的MIC。细菌耐药表型的检测（三）4.革兰阴性细菌4.1对P-内酰胺类药物4.1.1耐药机制在革兰阴性细菌中，因为PBPs改变而导致的耐药较少见，也有人报道在铜绿假单胞菌、淋病柰瑟菌、醋酸钙不动杆菌等革兰阴性细菌中发现PBP的改变。产生各种不同的P-内酰胺酶是许多革兰阴性菌对P-内酰胺类药物耐药的重要原因，以此还有降低了外膜的透入以及主动外流等耐药机制。p-内酰胺酶的分类方法很多，Bush根据酶的底物和抑制物轮廓（profile）以及分子结构对p-内酰胺酶进行的分类，是目前人们最普遍接受的分类方法（表13-3）。表13-3p-内酰胺酶分类Bush组分子型分类最适底物代表酶1C头孢菌素类AmpAmpC酶（革兰阴性杆菌）2aA青霉素类青霉素酶（革兰阳性菌）2bA青霉素类，头孢菌素类TEM-1，TEM-2，SHV-12beA青霉素类，窄谱、超广谱头抱菌素，单环内酰胺类TEM-3至TEM-26,SHV-2SHV62brA青霉素类TEM-30到TEM-362cA青霉素，羧基青霉素PSE-1，PSE-3，PSE-42dD青霉素，cloxaciHinOXA到OXA-11,PSE-2（OXA-2）2eA头孢菌素普通变形杆菌诱导的头孢菌素酶2fA青霉素，头抱菌素，卡巴配能NMC-A（阴沟肠杆菌），Sme-1（粘质沙雷菌）B多数B-内酰胺类，包括卡巴配能L1（嗜麦芽窄食单胞菌），CcrA（脆弱拟杆菌）ND青霉素青霉素酶（洋葱伯克霍德菌）TEM-1和SHV-1分别是大肠杆菌埃希菌和克雷伯菌中最常见的B-内酰胺酶，它们由质粒介导，能有效地水解青霉素类和窄谱头孢菌素，但几乎不能水解超广谱的氧氨头孢菌素（头孢噻肟、头孢他啶等）、头霉菌素（头孢西丁、头孢替坦）、单环内酰胺（氨曲南）和卡巴配能类（泰能和美平）。由TEM和SHV-型突变而产生的超广谱B-内酰胺酶（ESBLs）主要存在于肺炎克雷细菌和大肠埃希菌，能够水解超广谱头孢菌素和单环内酰胺类药物，但对酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦敏感。但是在1990年发现了由TEM-1突变产生的B-内酰胺酶（非ESBL），对B-内酰胺冷-内酰胺酶抑制剂结合药物的耐药，它们在Bush分类中属于2br组。ESBL突变不仅仅局限于TEM和SHV型酶，在铜绿假单胞菌中已经检测到由OXA型酶的突变株（2d组），它们对超广谱头抱菌素耐药，通常不被克拉维酸抑制。几乎所有的肠杆菌科细菌（除沙门菌属、克雷伯菌属）和铜绿假单胞菌都正常产生由染色体ampc基因编码的AmpC酶（1组），它们是一种诱导型的酶，诱导机制还不十分清楚。可能在使用B-内酰胺类药物后，影响了细菌细胞壁的合成，使胞质中糖肽类降介产物堆积，使调节基因ampD突变，导致ampC变为稳定的去阻遏状态，持续高水平产酶。在正常情况下，酶产量很低，当存在B-内酰胺诱导物时，产酶率可成百倍的升高。头抱西丁、泰能和克拉维酸是较强的诱导剂。此外还有有酶活性中心需要金属离子的金属酶（3组）等。4.1.2实验室检测NCCLS推荐的ESBLs检测方法可分为初筛试验和表型确证试验（国内亦称双纸片增效法），可用于肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌中ESBLs的检测。初筛试验方法同常规KB纸片扩散法，检测纸片有头抱他啶、头抱噻肟、头抱三嗪、头抱泊肟和氨曲南。抑菌圈直径出现头抱他啶W22mm、头抱噻肟W27mm、头抱三嗪W25mm、头抱泊肟W22mm、氨曲南W27mm时（只要有一种），即可疑有ESBLs产生。需做确证试验才能报告结果。确证试验方法也同KB法，选用两对抗生素纸片，一对为头抱他啶（30pg/片）和头抱他啶/克拉维酸（30pg/10pg/片）；另一对为头抱噻肟（30pg/片）和头抱噻肟/克拉维酸（30pg/10ug/片）。2对中任何一对加克拉维酸的纸片比不加克拉维酸纸片抑菌圈直径三5mm,即判为产ESBLs表型。质控选用大肠埃希菌ATCC25922（加克拉维酸后的抑菌圈直径比单药增大W2mm）和肺炎克雷伯菌ATCC700603（头抱他啶加克拉维酸抑菌圈直径比单药增大三5mm,头抱噻肟加克拉维酸抑菌圈直径比单药增大23mm）。两种复合药物的纸片目前国内尚无生产，英国Oxiod公司有产品出售。生物梅里埃公司Vitek系列可用GNS-NT药敏卡或GNS-506药敏卡检测ESBLs（该卡目前设置0.5pg/ml头抱他啶、0.5pg/4pg/ml头抱他啶/克拉维酸和0.5pg/ml头抱噻肟、0.5pg/4pg/ml头抱噻肟/克拉维酸4个孔，能检测出大多数产ESBLs的菌株）。无法开展以上确证试验的实验室，也可采用双纸片扩散法。这种方法将阿莫西林/克拉维酸纸片贴在平皿中间，四周贴前面提到的筛选试验的4〜5种纸片，纸片间距常选20mm,当阿莫西林/克拉维酸纸片与周围任