猕猴桃细菌性溃疡病菌

猕猴桃细菌性溃疡病菌（一）概述学名Pseudomonassyringaepv.actinidiaeTakikawaetal.异名Pseudomonassyringaepv.morsprunorum（Wormald）Youngetal.英文名称bacterialcankerdiseaseonkiwifruit.分类地位薄壁菌门Gracilicutes,Proteobacteria纲假单胞菌科Pseudomonadaceae假单胞杆菌属Pseudomonas1分布国内北京市（房山区）；河北省唐山市（遵化市），保定市（涞源县）；辽宁省丹东市（宽甸满族自治县）；安徽省安庆市（岳西县）；江西省上饶市（弋阳县）；山东省临沂市（兰山区）；河南省三门峡市（卢氏县），洛阳市（洛宁县、嵩县），南阳市（南召县、西峡县、内乡县、淅川县）；湖北省十堰市（房县），咸宁市（通山县），恩施土家族苗族自治州（建始县）；湖南省常德市（石门县）；四川省广元市（苍溪县）；陕西省西安市（长安区、灞桥区、蓝田县、户县、周至县），宝鸡市（陈仓区、眉县、太白县），商洛市（商南县），咸阳市（武功县）。国外日本、韩国、新西兰、美国。2寄主植物猕猴桃细菌性溃疡病菌主要危害中华猕猴桃Actinidiachinensis等猕猴桃属Actinidiaspp.植物；人工接种寄主桃Prunuspersica、杏P.armeniaca、李P.salicina、梨Pyrussp.、樱桃Cerasuspseudocerasus、梅P.mume等轻度发病［1-3］。3经济重要性猕猴桃细菌性溃疡病又称猕猴桃溃疡病，是一种毁灭性细菌病害。该病主要危害猕猴桃的主干、枝蔓、新梢和叶片，极易造成植株死亡。该病1980年在日本首次发现，1983年后在美国等陆续发现d987年病原菌被鉴定为丁香假单孢杆菌猕猴桃致病性变种Pseudomonassyringaepv.actinidiae。1984年以前，我国没有猕猴桃细菌性溃疡病分布，1985年最早发现于湖南东山峰农场，并在短短的10年时间里，迅速扩散蔓延到我国多数猕猴桃栽培区域。该病来势凶猛，常常大规模暴发，导致大面积毁园，造成严重的经济损失，直接威胁猕猴桃产业的发展。1996年猕猴桃细菌性溃疡病菌被列入我国森林植物检疫对象名单1-3］。4症状与病原形态［1,4,5］该病初期在罹病叶上形成红色小点，后形成2-3mm不规则暗褐色病斑，病斑周围有明显的黄色水渍状晕圈。湿度大时，病斑迅速扩大为水渍状大型病斑，其边缘因受叶脉限制而成多角形，也有许多病斑不产生晕圈。数个病斑愈合时，主脉间全成暗褐色，并有菌脓溢出，有时叶片向里或向外翻卷。细弱的小枝条发病时，初呈暗绿色水渍状，不久变为暗褐色，并产生纵向线状龟裂，病症向不断伸长的新梢和茎部扩展，很快使整个新梢成暗褐色而萎蔫枯死。此时如遇高温，病部及周围健康的皮孔，可溢出白色水滴状的菌脓。该病原细菌的菌体为直杆状，有的稍弯曲，大小为1.4-2.3）pmX（0.4-0.5）pm，多数极生单鞭毛，少数为2-3根。革兰氏染色阴性，不具荚膜，不产生芽孢和不积累聚8羟基丁酸脂，在含蔗糖的培养基上菌落粘稠状，氧化酶反应阴性，在烟草幼苗上有明显的过敏性反应，在金氏B培养基上有黄绿色荧光产生，41°C以上不能生长。5生物学特性［刀一般于1月中、下旬在芽眼周围、叶痕、皮孔、枝干伤口及表面侵染发病。病部产生纵向线状龟裂，溢出水滴状白色混浊菌脓，后逐渐变粘稠，呈黄白色和淡褐色，不久皮层坏死呈红色或暗红色，也有直接自树皮溢出并混有暗红色汁液。病部组织下陷呈溃疡状，上部枝条萎蔫死亡。随着病原细菌在皮层中的移动，溢出菌脓范围不断向枝的顶端和基部扩展。主干受害严重造成整株枯死，而且会很快从症状停止扩展的近地面部位或砧木等部位长出旺盛的新梢。病原菌通过伤口、皮孔、叶痕侵入枝干的薄壁细胞组织，在这些组织中繁殖并产生胞外多糖，被侵染的组织坏死，形成溃疡斑。溃疡与健康组织间界线明显，病部下陷、变色、开裂，并分泌大量菌脓。枝干于1月中、下旬开始发病，2月上、中旬以后病情急剧发展，尤其在发育不成熟的夏秋梢上更加严重，菌脓溢出量以从新梢顶端迅速伸长期开始到4月为止的这一时间内最多，5月中下旬极少溢出。罹病枝条和树干溢出的菌脓是枝、叶、花和春梢的初侵染源，叶片病斑和未成熟枝条病部在雨期、雨后和早晨高湿时溢出的菌脓是再侵染源。7月下旬见不到新发病的枝叶。人工接种，通常7-10d后明显表现症状，9-10月寄主均可产生暗褐色愈伤组织，11月以后接种则产生红褐色或暗绿色水渍状病变，并有白色菌脓溢出。2月上、中旬以后的树体汁液活跃流动期，病情发展迅速，潜育期亦短。旬均气温低于15r，枝条发病率高，冬季修剪后伤口不易形成愈伤组织，发病率增加［1-3,6］。病原菌在病组织、土壤表层和野生猕猴桃上越冬。6传播途径病原菌的自然传播依靠雨水滴溅完成，而远距离传播主要依靠人为调运接穗等活体实现。7适生范围目前，国内猕猴桃细菌性溃疡病菌在亚热带、温带、寒温带已有发生，而且中华猕猴桃等感病树种在我国广泛分布，有中华猕猴桃栽植的区域都有可能发生该病。猕猴桃细菌性溃疡病最适发生区是从湖南到陕西秦岭北麓(北纬24°—34°)的大部分地区。8防治措施加强栽培管理。夏季修剪以摘心、疏枝、疏果为主，冬季修剪应在落叶1周后开始，最迟不晚于1月中旬，少留枝多留芽；冬灌时以农家肥为主，同时配施适量的磷肥、钾肥，萌芽期追施氮肥，开花期、座果期、果实膨大期追施磷肥、钾肥，提高树体的抗病性；冬季涂白也是重要的预防措施"］。修剪伤口发现菌浓的即从健部剪除，或涂布伤口愈合剂。主干带疫的应刮去病部及其周围健康组织，或铲除病株。修剪后伤口涂布愈合剂，修剪工具应经常消毒8910］。用6%春雷霉素可湿性粉剂400倍液或波尔多液等防治。在新梢萌芽到新叶簇生期进行第一次用药，以后每隔10d左右用药1次，喷洒数次。早期防治要彻底。在落叶期间和修剪后均需用药防治数次［8,9,10］。参考文献［1］ 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宋晓斌,王培新.猕猴桃细菌性溃疡病生物防治初步研究［J］.西北林学院学报，2002,17（1）:49-50,73段余君，陈秀琴.猕猴桃溃疡病的发生及防治[J].林业实用技术,2002（7）:31-31田呈明，梁英梅,高爱琴，等.基于栽培管理措施的猕猴桃细菌性溃疡病防治技术[J].西北林学院学报,2000,15（4）:72-76（二）检疫技术操作办法1主题内容及应检范围1.1本办法规定了猕猴桃细菌性溃疡病菌Pseudomonassyringaepv.actinidiaeTakikawaetal.的检疫检验及检疫处理操作办法。1.2本办法适用于林业植物检疫机构对猕猴桃属Actinidiaspp.植物活体、残体的检疫检验和检疫处理。2产地检疫2.1种苗繁育基地的建立2.1.1培育的猕猴桃，应从无病区采集接穗，或用无病虫的当年生半木质枝条作插条。2.1.2加强晚秋水、肥管理，避免在强风和冬季低温的高海拔区，即易发生霜冻的地方建园。2.2踏查2.2.1在种苗繁育基地、猕猴桃栽植地的果园、林场，以自然界线、道路等为单位进行线路（目测）踏查。2.2.2调查寄主的主干及分枝上部是否有淡黄色或黄褐色病斑；病斑处是否有小孔，从中向外流出白色或铁锈色液体，病部下方形成深褐色污斑。2.2.3调查枝条上是否有暗绿色或暗褐色水渍状纵向、线形龟裂；新梢是否呈暗褐色萎蔫枯死，病部浸出白色水渍状液体。2.2.4调查叶片上是否有红色小点，或大小为2-3mm的褐色多角形病斑，周围有明显黄色水渍状晕圈，叶片向里或向外翻卷。2.2.5确认有疫情需进一步掌握危害情况的，需设标准地（或样方）做详细调查。2.3标准地（或样方）调查2.3.1种苗繁育基地样方设置与调查2.3.1.1样方的累积面积应不少于调查总面积的5%。2.3.1.2每块样方面积为0.1hm2,采取棋盘式取样法，抽取样树5-10株，进行病害分级调查。2.3.2.果园标准地设置与调查2.3.2.1按果园面积设置，10hm2以下（含10hm2）设1块，每增加5hm2增设1块。2.3.2.2每块标准地面积为0.1hm2,采取棋盘式取样法，抽取样树10株，进行病害分级调查。2.4病害分级标准单株病害分级标准I级全株叶、蔓无病 代表值0;II级1-20片叶和1个侧蔓发病，或1/3以下的新梢发病 代表值1；m级21-30片叶和2-3个侧蔓发病，或1/3-1/2的新梢发病代表值2；W级31片以上叶和1-2个主蔓发病，或1/2以上新梢发病 代表值3；V级主干发病1/3,或多数侧蔓发病、植株部分枯死 代表值4；W级主干发病1/3,或全部主蔓枯死发病、全株枯死 代表值5。果园病害分级标准（以被害株率为标准）轻被害株率10%以下；中被害株率11%-30%；重被害株率31%以上。2.5所采集的感病材料应包含植物的所有部分和各种症状部分。应尽可能采集感病初期的病株部分，以利于病原细菌的分离。2.6样品置于聚乙烯袋内或其它合适容器内保鲜和防止污染。样品应冷藏存放，避免受到阳光的照射。3调运检疫3.1抽样比例3.1.1苗木100株以内（含100株）的应全部检查；100-1000株按10%抽取；1000株以上按一批货物总件数（株）的5%抽取。3.1.2植株及植株残体应全部进行检查。3.2抽样方法3.2.1苗木按照抽样比例，采取分层方式设5个样点进行抽样。3.2.2对携带有病症的植株及植株残体应全部进行检查。3.3现场检验3.3.1检查寄主的叶片是否向里或向外翻卷，并有红色小点或多角形病斑，周围有明显黄色水渍状晕圈。3.3.2检查1-2a枝条上是否有水渍状纵向、线形龟裂，新梢是否萎蔫枯死，并有白色水渍状液体溢出。3.3.3检查寄主干部是否在病斑下方呈深褐色并有铁锈色液体溢出。4检疫检验4.1溢菌检验在具典型症状的病部上，取病健交界处的一小块病组织，在显微镜下切片检查是否有大量细菌液溢出。4.2分离培养检验4.2.1取小块病斑组织，经表面消毒，灭菌水洗3次后，研碎静置10min，采用假单孢属选择性培养基进行分离，将分离并经纯化后的细菌移植到BPA培养基斜面上培养48h，置8°C冰箱保存。分离鉴定方法见附录1。4.2.2检查在BPA培养基平板上是否形成污白色、圆形、全缘、凸起、光滑、直径约为1-3mm的菌落；在KBA培养基上未见荧光；在Luisetti培养基上发生蓝色荧光及在SPA培养基上呈粘液状菌落。染色检验4.3.1鞭毛染色采用西萨一基尔染色法。经染媒5-7min-水洗干燥一苯酚品红染色5minf水洗干燥后镜检。显微镜下菌体和鞭毛为阴性反应，呈红色，极生1-3根。4.3.2革兰氏染色采用结晶紫草酸胺染色法。经固定涂片一染色1min-水洗数秒吸干一碘液处理1min-水洗数秒吸干一褪色30s-水洗数秒吸干一复染10min-水洗吸干后镜检。显微镜下菌体为革兰氏阴性反应，呈红色。生理生化检验4.4.1生长与温度试验菌株生长最高温度为35C；最适生长温度为25-28C；致死温度为55C条件下10min。4.4.2精氨酸双水解酶检验配制Thornley培养基。每试管装3-4ml培养基灭菌t冷却T针刺接种细菌至培养基底部立即用灭菌凡士林封管一在27r条件下培养7d。在此条件下，精氨酸双水解酶为阴性，颜色不变。4.4.3果聚糖（Levan）试验用细菌悬浮液，在SPA培养基上，或用葡萄糖代替蔗糖培养基平板上分别划线。在25r条件下培养3-7d，形成白色、粘稠、圆顶、隆起而有闪光的菌落为阳性反应。在此条件下，在SPA培养基上可形成前述菌落，果聚糖试验为阳性；而在用葡萄糖代替蔗糖培养基上，不形成前述菌落。4.4.4冰核活性测定用直径16mm的螺口试管，装浓度大于168CFU/ml细菌液3-5ml，加盖置于-4r水浴中（水浴含11.2%的食盐水）。如此液在5min内结冰，表明有冰核活性。在上述条件下，菌液经测定为无冰核活性。4.5碳素化合物的利用和分解4.5.1碳素化合物产酸试验配制Ayers培养基。在适温下放置4-5d后，每5ml培养液接种0.1ml含108CFU/ml的菌悬浮液，适温下培养3-4周，产酸时培养液变为黄色。在此条件下，培养液变为黄色，能利用葡萄糖、棉子糖、山梨糖、蔗糖产酸。4.5.2V.P试验（产生3羟基丁酮试验）将细菌接种于甲基红试验用培养液，培养2-4d，按每毫升加40%KOH（含0.3%肌酸或肌酐）0.1ml溶液，置48-50r水浴中，充分摇动2h，在4h内观察出现红色为阳性反应。在此条件下，培养液测验为阴性反应，不呈红色。4.5.3甲基红试验（MR试验）将细菌接种于葡萄糖蛋白胨培养液，适温下培养2-4d以上，取培养液5ml，加甲基红试剂2-3滴。培养液变红色为阳性反应，黄色为阴性反应。在此条件下，培养液测验为阴性反应，呈黄色。4.6氮素化合物的分解4.6.1硝酸盐还原试验将硝酸盐半固体培养基用4%NaoH调节pH至7.0-7.2。每支试管分装5-10ml培养基灭菌，针刺接种细菌。试管培养3、5、7d后，分别用Griess-Liosvary试剂测定法测定亚硝酸。如呈红色，表示有亚硝酸根为阳性反应。在此条件下，培养液测验为阴性反应，不呈红色。4.6.2吲哚试验4.6.2.1配制胰蛋白胨10.0g、酵母膏5.0g、蒸馏水1000.0ml的培养液，接菌后适温培养。4.6.2.2将滤纸剪成小条，在饱和草酸溶液中浸过后取出，灭菌烘干后，夹在棉花塞和管壁之间，使滤纸悬挂在不接触培养液的液面上，有吲哚产生的滤纸变淡红色。在此条件下，滤纸不变淡红色，不产生吲哚。4.7大分子化合物的分解4.7.1明胶液化在BPA培养基中加10%-12%的明胶，每支试管4-10ml，在121°C灭菌12-15min，冷却后用穿刺法接菌，在适温中培养3、7、14和21d，将试管取出置冷水和4C冰箱中，使明胶凝固，检查明胶是否凝固或液化，并以未接菌的明胶作对照。在此条件下，该菌株不能使明胶液化。4.7.2石蕊牛乳反应用石蕊牛乳培养液，间歇灭菌3次，每次通蒸气20-30ml。接种后于28C条件下培养，以不接种的石蕊牛乳作对照，定期观察4-6周。在此条件下，石蕊牛乳反应变蓝，示有微碱性。4.7.3吐温80的水解采用Sierra方法测定。将吐温80高压蒸气灭菌后，取10ml加入蛋白胨10g、CaCI•2H2O0.1g、琼脂17g、蒸馏水1000ml，pH7.4的培养基中，混匀后制成平板，点种细菌，适温培养7d。如在菌落周围有不透明白色沉淀区出现，表示吐温80被水解，为阳性反应。在此条件下，吐温80能水解，为阳性反应。4.8其它生理生化试验4.8.1氧化酶试验在培养皿内放一张滤纸，滤纸上加3-4滴1%二甲基对苯二胺盐酸盐，使其湿润。用玻棒挑取生长24h的菌苔涂在滤纸上，若菌苔在10s内变成紫色，为阳性反应；在60s以后变色或一直不变色，为阴性反应。在此条件下，菌苔的氧化酶试验为阴性反应。4.8.2过氧化氢酶（接触酶）试验挑取在固体培养基上生长24-48h的菌苔，置于干净玻片上，滴加3%的过氧化氢，30s内有大量气泡产生为阳性，不产气泡为阴性。在此条件下，菌苔过氧化氢酶试验为阳性。4.9致病性测定4.9.1烟草过敏性反应将在26r条件下，培养72d的菌株，用无菌水配成3X108/ml的菌液，对烟草下表皮进行皮下接种，在24。。条件下经20-24h后检查是否出现过敏性坏死斑。4.9.2植株致病性测定将分离菌株接种在植株健叶或休眠枝条上，菌液浓度6X108/ml。10-15d后或次年2月下旬到3月下旬，检查是否出现典型叶斑症状，具晕圈；休眠枝条有溃疡症状及菌浓。根据上述检验结果，对照病原特征（附录2），鉴定是否为猕猴桃溃疡病菌Pseudomonassyringaepv.actinidiaeTakikawaetal.5除害处理5.1禁止从疫情发生区调运染疫植物活体。5.2发现带疫植株应喷洒1万单位农用链霉素3000倍液、30%琥珀酸铜（DT）胶悬剂200倍液或70%百菌通500倍液分2-3次进行处理。附录1猕猴桃细菌性溃疡病菌的分离鉴定方法1、 病原鉴定根据叶片上的水渍状晕圈和枝干上白色水滴状菌脓初步诊断为细菌性病害。取病健交界处组织一块，放于载玻片上，向小块上滴1-2滴无菌水或蒸馏水，加盖玻片后。立即用低倍显微镜观察水滴与组织交界处，见到云雾状菌溢，亦可证明组织内有细菌存在。2、 病原分离新鲜病健交界处的病组织洗净后切成4mmx4mm小块，用灭菌水冲洗3次;分别用70%酒精和0.5%-1%的次氯酸钠进行表面消毒，病组织在消毒液中浸泡1-2min，再用无菌水冲洗3次，按下列方法进行分离。培养皿稀释分离法：取灭菌后的培养皿3-4个，每皿加灭菌水0.5m1，将经表面消毒并充分冲洗的病组织小块移至第一皿的水滴中，用灭菌玻璃棒碾碎，静置30分钟左右，是组织内细菌流入水中，配成悬浮液。用灭菌后的接种环从第一皿内移植2-3环至第二皿内并充分、混合后再移植到第三皿，依次稀释到最后一皿。将熔化的琼脂培养基冷却至45°C左右，倒入每个皿中，在培养基未凝固前，轻转动培养皿，使培养基与菌悬液混匀，冷却后将培养皿翻转，置25-30C下培养。平板划线培养法：将上述的病组织放在灭菌载玻片上的一滴灭菌水中，玻棒搅碎，静置一段时间，用灭菌的接种环在普通培养基或选择性培养基上划线培养。培养基可选用：肉汁胨琼脂培养基（BPA）:牛肉浸膏 3.0g蛋白胨 5-10g

蔗糖酵母膏10.0g1.0g琼脂17.0g蒸馏水1000mlpH7.0培养性状：菌洛圆形，污白色，全缘，微凹，光滑，生长缓慢，直径约1-3mm。蔗糖蛋白胨培养基（SPA）:蔗糖3.0g蛋白胨5.0gK2HPO40.5gMgSO4-7H2O0.25g琼脂17.0g蒸馏水1000mlpH7.2-7.4培养性状：菌落呈粘稠状。金氏B培养基（KBA）:甘油10.0g膘蛋白胨(proteosepeptone) 20.0gK2HPO41.5gMgSO4-7H2O1.5g琼脂（水洗）17.0g蒸馏水1000mlpH7.2培养性状：有黄绿色荧光。3、致病性测定应选择未成熟的及正在迅速生长的植物的新梢、新叶进行；尽可能模拟自然侵染方式接种寄主。将培养24-72h的单胞菌落制成菌悬液，浓度为3x108CFU/ml，进一步稀释到104-107CFU/ml,用针刺法或涂抹伤口法对