纤维素酶的蛋白质工程

纤维素酶的蛋白质工程摘要：纤维素酶是能够水解纤维素0-1,4-糖苷键的酶类。通过序列分析鉴定纤维素酶在82类糖苷水解酶家族中占13种，但传统上它们被分为两类，分别是内切葡萄糖苷酶和外切葡萄糖苷酶。这两类纤维素酶均可降解液体纤维糊精和非晶状纤维素，但是也有一些特别的例外，即只有外切葡萄糖苷酶可以有效地水解晶状纤维素。定点突变已经成为鉴定纤维素酶的主要方式，从催化剂的鉴定到确定粘合残基，由于晶体学原因，酶-底物复合物被限制通过包括糖苷合成酶在内的新的改良酶结构。同时对于可溶性底物和底物类似物的研究已经提供了丰富的信息，但对于天然底物的降解机制和晶体纤维素的研究，还有很大挑战。关键词：纤维素酶内切葡萄糖苷酶外切葡萄糖苷酶蛋白质工程定点突变结构合成寡糖1.绪论纤维素酶是能够水解纤维素0-1,4-糖苷键的酶类。在很多糖苷水解酶序列基础家族中都能发现纤维素酶。传统上纤维素酶被分解为两个类群，分别是内切葡萄糖苷酶和外切葡萄糖苷酶，反映了两个类群在水解晶状纤维素的酶活不同。一般来讲，外切葡萄糖苷酶比内切葡萄糖苷酶能更有效地降解晶状纤维素。纤维素酶被广泛用于各种工业目的，因此除了研究纤维素酶的定点突变，主要的研究还包括纤维素酶的克隆和表达。纤维素酶的蛋白质工程主要被作为研究催化机制的工具。这涵盖了活性中央残基的诱变潜能，它们的后续动态分析，且多基于序列基础家族类别中的不变残基鉴定。无活性的变种常作为研究三维水平下蛋白质—配体复合物的工具。这种三维复合体已经被用于检测糖苷水解酶的修改和利用。分析特定的底物决定子已经使酶工程具有修改功能。近来，在合成酶体系又有了令人振奋的进展，通过构建无水解活性的糖苷水解酶突变型，被称作糖苷合成酶。这类酶具有高效产生寡糖的潜能，不论是作为推动酶学研究的工具还是具有潜在的疗效。一些工业酶的性质，例如洗涤剂和腐质霉属Cel45A的共溶性有所增强。当我们关注一种底物时，其他一些重要因子：如与分解晶状纤维素这一目标有关的、修改这一特征和特定的工程学特征都会被关注到分解纤维素的酶系统中。虽然事实上一些序列基础家族与内切葡萄糖苷酶和外切葡萄糖苷酶十分相近，但是这些强有力的修改都不算成功。在敏感的价格市场，尤其是在生物降解方面，当前的挑战是如何高效又廉价的分解大量的晶状纤维素。当然，在这一过程中我们也有一些小的成就。在描述大量的成功的生物工程实例之前，我们先总结一下作为底物的纤维素自身，纤维素酶的各个家族，它们的三维结构以及催化机制。1.1.纤维素的结构纤维素是由被0-1,4-糖苷键连接的葡萄糖残基组成的复杂而独特的结构。这种合成的线性聚合链有超过10000个葡萄糖残基且是不溶的。那些单链并不是单独存在的，实际上它们相互黏着并联形成了晶状微纤维。微纤维的大小和结晶度基于端点的不同而变化。并且，纤维素的纯化和干燥等物理处理也会影响到结晶度和聚合程度。最终纤维素含有大量的结晶和部分非结晶区域，结晶度也不像微纤维那样一致。只有那些特殊来源的纤维素，例如从藻类和细菌中提取的纤维素具有近乎完美的结晶度。它们经常被作为底物模型来检测各类可降解晶状纤维素的纤维素酶。纤维素酶的序列家族：从序列到三维结构基于氨基酸序列的相似性，糖苷水解酶被分为80多个家族。运用序列基础分类法，对于早期序列基础比对的纤维素酶均可查找。并且随着不断的完善，现在可以涵盖所有已知的糖苷水解酶家族。大量的纤维素酶基因都已经被克隆。在(5,6,7,8,9,12,26,44,45,48)这十个序列家族中可以发现它们，纤维素酶类似物也被提议放入第61和第74家族。现在，大概有450种纤维素酶基因可以再公共数据库中查到。对于5-9,12,45和48[8,9]家族的纤维素酶，它们的三维结构都是可以查到的。尽管实际上它们都可以降解0-1,4-糖苷键，但是它们显现在拓扑学上却结构各异，从所有的0折叠蛋白质、0/a-折叠桶蛋白质到a-螺旋蛋白质。在1990年，木霉属的reeseiCel6A(CBHII)，作为第一个被刊发出三维结构的纤维素酶。从此以后8个家族中20多种纤维素酶的三维结构被列出。这其中有三个家族是外切葡萄糖苷酶的典型代表。一个值得注意的特点，不仅纤维素酶而且很多糖苷水解酶都有自身的调制性。蛋白质很少作为单一催化区域实体，但却可以作为一个或多个序列组件结构来联系一个或多个无催化性序列组件。无催化性序列组件经常参与蛋白质-碳水化合物和蛋白质-蛋白质的交互作用。所有的无催化性序列组件，包括碳水化合物粘合区域，都被划归入序列基础家族。低溶解性的纤维素可以耐受水解作用：酶在降解晶状物质时，不仅必须要发挥水解作用，而且必须使单糖链上的氢键断裂并使之远离晶体结构且维持这一状态，与此同时，还要完成多项酶解反应。这些酶在这一进程中有不同的形态。进行性酶，例如外切葡萄糖苷酶，通过一个可以保留单糖链的附着通道并阻止它向纤维素晶体靠近来维持自身的酶结构。类似的进程反应也许也可以通过结合附加的粘合区域靠近活化中心来达到，例如第九家族的E4酶就密切的伴随有CBM3a区域。对于纯粹的内切酶，内切可溶多糖链时，典型地作为开放底物粘合裂隙时，催化结构有可能才建立。糖苷水解酶的催化机制糖苷水解酶通过酸碱催化作用来断开糖苷键。催化作用可以通过异头碳原子位构型保留或者是构型的转化来完成。催化机制已经很好的表现出来并且经常被总结。自从这些酶的蛋白质工程主要目标之一催化机制已经被阐明，我们就必须首先在更多的细节上关注两个反应机制。倒位是一个简单的移位反应。催化酸能够提供氢离子促使其基团离开（糖苷羟基有较高的酸离解常数致使它难以离开基团），同时催化碱需要一分子水来置异头物中心换亲核基团。酸和碱通常距离7-13埃，来调节吡喃环下的亲核水。在很多纤维素酶系统，催化碱的存在都是有争议的。正如Koshland在1953年描述的那样，共价糖基酶中间体形成后，便开始水解，通过羰基阳碳离子类似物转换来形成。这需要两个残基，一个酶亲核基团和一个被称作布朗斯泰德酸的酸碱催化剂，先使离开基团质子化以协助离开，并发挥碱的作用；第二步将水亲核基团质子化。截止现在我们研究的所有系统中，亲核基团和酸碱催化剂常距离5-6埃。有一点需要注解的是，通过定位蛋白质的功能基团而确定酶促机制，每个家族的催化立体化学也得以保持。纤维素酶的工业应用直到90年代纤维素酶才有重大工业价值。它们在纺织工业上发挥了很大的商业作用，随着生物磨光的发展和减少绒毛的需要，降低纺织物起球，进入了石磨洗的代入。它们在纸和纸浆工艺中有很大的潜力。它们在洗涤工业发挥着不同的作用：它们移除松动的绒毛来使褪色的衣服变的光亮，另外由于反射散射光而导致无光外观。对于棉料衣物它们也能够清洗。近30年来运用纤维素酶来降解生物已经扩展到较大的应用范围。但是，由于纤维素酶的价格或者纤维素酶的效率较低，导致这类应用在经济上没能拓展开来。2.纤维素酶的蛋白质工程下面详细叙述一些家族的纤维素酶的蛋白质工程的成功范例。2.1.第五家族纤维素酶第五家族包括纤维素酶、甘露聚糖酶、外切-0-葡聚糖酶等在内的不同种类的水解糖苷酶。这一家族的所有纤维素酶都是内切葡萄糖苷酶。这些酶都表现出了相同的折叠，且通过异头碳原子位构型保留来完成酶促反应。最早的蛋白质工程的成果是有密切联系的纤维素酶如何展现出不同的状态，例如最适酸碱度。在序列水平上，不同芽孢杆菌属纤维素酶有60%是相同的。两种纤维素酶的亲交子代产生量的工程试验：一种碱性枯草杆菌属N4纤维素酶（NK1）和另一种中性枯草芽抱杆菌纤维素酶（BSC）。通过定点突变进行复杂的氨基酸交换，以BSC作为参照，对中性NK1的5区残基进行诱变。两个氨基酸残基，丝氨酸287和丙氨酸296，在碱性排列中对活性起到了重要作用。通过双重变异，丝氨酸287变异为天冬酰胺、丙氨酸296变为丝氨酸，这样就使NK1的酸碱活性侧面和BSC近乎一样。另一方面，对于酸性排列，像上述两个五区那样的几个氨基酸变异对其酸碱活性并无太大影响。这一实验结果，以及其他一些内切葡萄糖苷酶所提供的信息，说明了上述两个氨基酸底物通过氢键网的重排对底物粘合位点或催化位点产生了重大影响。菊欧文氏菌Cel5A系统是一个利用琥珀抑制系统来研究纤维素酶功能的优秀范例。这一系统有七个对分解纤维素活酶活性有重大关系的保守残基。这一系统含有从嗜热厌氧梭菌、解纤维梭菌、芽抱杆菌属agaradhaerens、E.chrysanthemi酶、和aThermobiCdafuscap-甘露聚糖酶在内的第五家族酶的三维结构都可以鉴定和分析催化残基。2.2.第六家族纤维素酶T.reeseiCel6A是第一个测出三维结构的纤维素酶。从1990年开始，已经报道了从T.fusca中筛选的内切葡萄糖苷酶Cel6A，还有从腐霉中筛选的外切葡萄糖苷酶Cel6A及内切葡萄糖苷酶Cel6B。这些蛋白质的拓扑学结构式是以由七个平行条带组成的P-折叠为中心的P/a-折叠。第六家族的酶通过异头碳原子位构型转化来完成酶促反应。尽管第六家族的酶已经进行了重要的蛋白质工程实验，但是通过比对结果，仍然是有密切练习系统的纤维素酶家族之一，使我们更难分析它的催化机理。由于潜在催化残基的变化，这些年来这一目标并没有因为数据库中的错误序列存在而有所进展。这种鉴定甚至是以Koshland单一移位机制为基础的酶促反应的存在仍然是受争议的。第六家族中第一个进行分析的酶，仍然是研究这类酶的典型，用来分析纤维单胞菌属fimi内切葡萄糖苷酶中的潜在催化残基。沃伦和他在温哥华的团队以T.reeseiCel6A和T.fusca内切葡萄糖苷酶的三维结构序列同源性为基础来研究C.fimi纤维素酶的蛋白质工程。通过定点突变，在C.fimiCel6A活性中心的四个保守的天冬氨酸系统的替换了丙氨酸和谷氨酸盐。三维结构完整性被进一步用在圆环二色性和粘合纤维二糖粘合桶。一些合成底物被用来选择不同的催化作用。酶的Michaelis-Menten参数已被用于2,4-二硝基甲苯纤维二糖糖苷和羧甲基纤维素钠。对于野生型C.fimiCel6A的最适pH来说，kcat取决于质子化集团和deprotonated基团的活跃程度，和酸碱催化剂的活跃位点保持一致。最初鉴定的蛋白质突变体表明了：对于C.fimiCel6A来说，天冬氨酸252和天冬氨酸392分别是酸催化剂和碱催化剂。在酸催化反应中天冬氨酸287可协助天冬氨酸252，而天冬氨酸216却对催化反应没有太大作用。C.fimiCel6A的天冬氨酸252丙氨酸突变型的最适是pH仅仅依赖于酸催化基团，且这一突变型仅仅在与DNP纤维二糖糖苷反应时表现出较高的活性，这表明了Asp252是一种酸催化剂。这些结果表明C.fimiCel6A通过包括酸催化作用和碱催化作用在内的典型换向机制来完成水解反应，这一机制首先被Koshland提出。这一提案并没有被广泛接受，并且其他人也提出了不同的解释和结果。康奈尔大学的大卫威尔逊和它的团队已经对T.fusca内切纤维素酶Cel6A研究很多年了。他们的工作主要集中在该酶的表面残基如何影响酶对底物的专一性。低活性的结晶纤维素表明纤维素进入活性位点的路径可能是水解结晶纤维素的限速步。这也成为一个圆环假说，在底物粘合中起到了重要作用。用定点突变技术共获得了15个表面突变体和5个环突变体。一种精氨酸237丙氨酸突变体对羧甲基纤维素的活性有所提高，但对其他底物的活性均无提高。芳香残基的突变关闭了活性位点从而降低了对一些底物的活性。这一结果解释了一个纤维素酶突变和动力学的基本问题。这些突变体分别对液体纤维糊精、羧甲基纤维素和结晶纤维素进行水解实验。所有的突变体除了一种对羧甲基纤维素的活性提高了175%以外，其他的突变体均没有提高酶的催化活性。后来从无催化残基中获取的资料：研究了14种第六家族Cel6A活性位点附近的保守残基对催化反应、底物专一性、持续合成能力和底物粘合亲和性的影响。四种残基的七种突变体对羧甲基纤维素的活性有所提升，七种赖氨酸259组氨酸创造了最高的催化活力。有意思的是，这些残基的其他突变体对对羧甲基纤维素的活性反而下降了。只有赖氨酸259组氨酸突变酶对acid-swollen纤维素活性高于滤纸，表明这一突变体是水解晶状纤维的限速步。所有的突变体都对纤维三糖和纤维四糖表现出较低的活性，但是有两种突变体，在次位点比Cel6A在2,4-二硝基苯基-0-D-纤维二糖糖苷有更高的kcat/Km值。这些结果表明那些保守的无催化残基也可能对T.fuscaCel6A的活性和专一性有影响。通过更多定点突变细节来研究内切葡萄糖苷酶的活性位点。四种T.fuscaCel6A的固定天冬氨酸残基突变体对应着C.fimiCel6A的突变残基，并且突变基因可由链霉菌属lividans提取。酶纯化之后在三种纤维素底物上测其活力，并且获得了2,4-二硝基苯基-0-D-纤维二糖糖苷上的资料。作用于phosphoricacid-swollen纤维素是为了用pH来筛选突变酶。每一种突变纤维素酶的粘合亲和性都通过两种荧光配体和纤维三糖来测定，并且圆环二色性光谱也有所记录。这些结果表明天冬氨酸117和天冬氨酸156在C.fimiCel6A残基中扮演着同样的角色：天冬氨酸117是一种酸催化剂，天冬氨酸156提升了天冬氨酸117的pKa。天冬氨酸79对于C.fimiCel6A残基没有独特的功能，但是在T.fuscaCel6A中，这种残基却可以提高天冬氨酸117的pKa并且有较高的催化活性。最初威尔逊团队根据T.fuscaCel6A的三维结构和对C.fimiCel6A的研究提出了潜在催化位点的定向突变，但是这仅仅加剧了人们对于基础催化残基的争论。T.fuscaCel6A的天冬氨酸265天冬酰胺突变体仅仅保留了野生型7%的催化活性，表明了这一残基并不是这一系统的催化位点。对比一下更高活性的C.fimi同源酶。我们可以进一步断定，我们实验室那些为刊发的资料，第六家族不同酶的突变位点会向我们提供出不同的结论。这也许就反映了协助催化的可能性：一个可选择位点在某些范围内可能会协助某一位点突变。据推测天冬氨酸175有可能是T.reeseiCel6A的位点。虽然发现天冬氨酸175丙氨酸突变体保留了20%的活性，但这一结果与从T.fusca、C.Cmi还有T.reesei自身获得的第六家族酶并不一致。淀粉微球基团也表明威尔逊首次提出的同等位点支持C.fimi的结果，天冬氨酸401,一种连接精氨酸353和赖氨酸395的盐键,构成了一个位点的特殊环境。通过研究一种Cel6A的三维结构，他们总结出天冬氨酸401作为催化位点可以使活性中心的底物发生重排。有一点是非常明晰的，在催化位点的问题解决之前，这一家族的纤维素酶我们还有很多工作要去做。晶体底物的活性工程在第六家族的外切葡萄糖苷酶作用于晶体底物时，我们比对它们的独特性质，发现了隧道包裹环，且这一发现已经被广泛接受。它们有可能作用于一个单糖链并且在催化反应中阻止它接近纤维素晶体。这就使持续水解底物可以进行下去。通过C.fimiCel6B的一个表面环的定点缺失巧妙的验证了这些环的作用。这种酶C-羧基近端环的缺失是为了尝试和模拟一种内切葡萄糖苷酶的性质。酶对于可溶性底物，例如羧甲基纤维素的活性提高了，同时在酶反应过程中对流动性底物的活性也提高了，这些结果提高了底物的内在分裂。对于T.reeseiCel6A的研究已经涵盖到+4次位点中的天冬氨酸727位点对晶体纤维素的活性。这表明在水解晶状纤维素隧道入口有较重要的芳香族疏水环境。最近康奈尔大学的研究小组又在报纸上发表了一些研究成果，他们用一种持续的纤维素酶T.fuscaCel6B，并且介绍了六种环涵盖了活性位点的十五个定点突变体。他们总结出所有的突变体酶对滤纸都有较低的活性，并且对于细菌微晶纤维素和SC有较低的持续合成能力。所以他们提出Cel6B的持续合成能力是水解不溶性和晶状纤维素的一个重要因子。第七家族纤维素酶第七家族的纤维素酶，正如之前所描述的那样，通过构型的保留来完成催化反应。这一家族的很多内切葡萄糖苷酶和外切葡萄糖苷酶的三维结构都已经明晰。三维结构是一个双0-sandwich，与豆荚凝集素家族中例如伴刀豆球蛋白A和第十六家族的地衣多糖酶的三维构象相似。内切葡萄糖苷酶和外切葡萄糖苷酶在结构上的差异主要体现在底物粘合位旁环的长度和性质的不同。在外切葡萄糖苷酶中这些圆环是展开的并且展现出隧道包裹形式。不论是第七家族的内切葡萄糖苷酶还是外切葡萄糖苷酶在活性中心都有一个“三位一体”的羧化物。通过研究这些残基的突变体和他们的同配酰胺物发现，这些残基，例如T.reeseiCel7A的活性中心是谷氨酸212-天冬氨酸214-谷氨酸217。那些从T.reesei中得到的突变体，酶通过超标达来保证其受到最小可能的污染。这些所有因素，三点突变较大的降低了酶的催化活性，尽管它们仍然保留了一些活性。在微发色底物2-氯-4-硝基苯和B-乳糖苷，kcat值降低到1/2000，而活性则分别是野生型的1/85和1/370，但是km值却基本上没有变化。谷氨酸212谷氨酰胺和谷氨酸217谷氨酰胺突变体作用于不溶性的底物BMCC基本上没有什么活性，但是天冬氨酸214天冬酰胺突变体却仍有活性。现在通过很多研究已经弄明白两种谷氨酸盐分别是催化亲核基团和催化酸碱位点。通过协同突变和三维构象，活性中心结构的几个突变最终形成了两个突变株:谷氨酸212谷氨酰胺和天冬氨酸214天冬酰胺，通过X光晶体学,T.reeseiCel7A谷氨酸212谷氨酰胺突变株结构有复杂的天然物：纤维二糖。在配体缺失的情况下，天冬氨酸214天冬酰胺突变体的活性中心有一个与谷氨酸212紧密相连的钙离子。但是谷氨酸212谷氨酰胺突变体却没有。这就支撑了在催化过程中谷氨酸212是带电体的假说。一种野生型T.reeseiCel7A结合有0-碘苄基-1-硫代-D-葡萄糖苷，纤维二糖与谷氨酸212谷氨酰胺的两个产物位点相结合。然而，纤维二糖残基和催化残基中纤维二糖远离三联体所形成的糖苷不同，糖苷与圆环有非常紧密的联系，且这一圆环是活性位点外围的组成部分。通过微淀粉球形成的突变体具有更高的溶解晶体结构，显示了一个纤维素链如何被底物粘合隧道所结合。活性位点突变体谷氨酸212谷氨酰胺和谷氨酸217谷氨酰胺是通过纤维寡糖结晶，并且显示出葡萄糖的部分覆盖次位点:-7到+4。粘合方式与纤维素残基产生过程相一致，并且支持了T.reeseiCel7A是从纤维素链末端切断纤维二糖开始反应的这一假说。第七家族也含有内切葡萄糖苷酶和外切葡萄糖苷酶。并且在催化晶状纤维素时有不同的催化活性，对于更难溶的底物，内切葡萄糖苷酶和外切葡萄糖苷酶有不同的活性，这也预示着酶上有更大数量的次位点。内切葡萄糖苷酶大概只有4-5个次位点。为了提高H.insolens内切葡萄糖苷酶Cel7B次位点的数量，构建了一个双突变株来模拟与之相对应的第七家族外切葡萄糖苷酶的次位点结构。获得了双突变株的三维晶体结构，并且双突变株色氨酸确实和在T.reeseiCel7A中发现的展开次位点在相同的位点。动力学测定表明，作用于可溶性微淀粉糊精时，H.insolensCel7B丝氨酸37色氨酸和脯氨酸39色氨酸突变体与Cel7B有大致相同的活性。phosphoricacidswollen纤维素时，有一个较小但却意义重大的变化，km值的降低说明了双突变体对于较长的多聚体底物确实有更好的粘合性。近来最令人振奋的是糖苷合成酶的构建：糖苷水解酶在寡糖合成上的突变体。通过第七家族H.insolens内切葡萄糖苷酶突变发展了一种更加强大的合成工具。这将被用在下面更过的细节中。第八家族纤维素酶第八家族酶是在异头碳原子位通过构型的转化来进行催化反应。它的酶分子三维构象是一个(a/a)6折叠桶。它的活性位点裂隙体系结构给至少五个葡萄糖粘合次位点提供了空间。Ozaki等用芽抱杆菌属KSM-330纤维素酶第一次鉴定了第八家族的催化残基。C.thermocellumCel8A的结构随后也被鉴定，且同源的谷氨酸95可以很容易的被鉴定出来。但是，研究者提出了问题，它们指定天冬氨酸152作为催化剂，由于天冬氨酸278也有这种可能性。第九家族纤维素酶第九家族酶通过异头碳原子位构型的转化来进行催化反应。这是纤维素酶中最重要的家族，因为迄今为止所有已知的植物纤维素酶都是属于这一家族的。该家族酶分子三维构象是一个(a/a折叠桶。一些结构显示出与免疫球蛋白类似物有较为密切的联系，例如C.thermocellumCel9A。有一些结构作为连接T.fusca内切葡萄糖苷酶Cel9A显示出与第三家族的CBM有紧密的联系。梭菌属stercorariumCelZ位于蛋白质的氨基末端的可能催化残基是天冬氨酸84和谷氨酸447通过定点突变被替换掉。最小量的CelZ催化剂是由催化域和比邻纤维素粘合域组成，lllc域C'家族被作为突变的靶位点。六个突变株酶和CelZC'蛋白质通过热稳定性和活性、底物专一性、产量和协同作用等方面进行比对。任何一个催化残基的改变都使CelZ分解微晶纤维素的能力完全消失，然而碱催化剂天冬氨酸84却在水解羧甲基纤维素时确保有内活性。这也许反映了催化剂通过羧化物来水解羧甲基纤维素。内活性C.stercorariumCelZ突变株在与不溶性纤维素反应时表现出部分活性缺失，且被用于和C.ster-corarium外葡聚糖CelY酶的协同研究。正如期望的那样，发现了依赖于CelZ外活性的协同现象。突变株天冬氨酸84甘氨酸和天冬氨酸84谷氨酸可以显著的增强水解晶状纤维素的能力，尽管我们从单个突变体的作用中并未发现任何被释放出来的产物。第四十五家族纤维素酶四十五家族纤维素酶在异头碳原子位通过构型的转化来进行催化反应。H.insolensCel45A原株的构型在1993年被测出，不久之后，一种含有低聚糖的无活性差异突变体天冬氨酸10天冬酰胺的结构也被测出。通过三维结构、原株、伴有纤维二糖和无浸透活性纤维六糖的野生型，向我们说明了它的结构是一个伴有长的互连环的06折叠桶。酶的表面有一个40埃的凹槽，催化残基天冬氨酸10和酸催化剂天冬氨酸121都在这个凹槽上。一个寡糖聚合物显示出在一个简单的移位、换向和反应机制中，溶剂水也参与了反应。一个大的构象改变替代了底物粘合。这种“轻盖子”提高了催化质子引入的疏水环境，是裂缝点的催化位点放入，并且在底物近似物中形成了第三种天冬氨酸突变物。催化残基的定点突变被用于判定酶的催化活性。这一家族的很多内切葡萄糖苷酶作用于无定性纤维素时都比羧甲基纤维素时有更高的活性，但却不能降解纤维素的结晶区。并且在底物粘合槽上进行的残基突变是在粘合点+1酪氨酸位点上完成的。这个氨基酸被其他十三个氨基酸替换，且动力学资料显示这一位置有一芳香族氨基酸是十分重要的。H.insolensCel45A已经被用于蛋白质工程改造以便提升其在工业领域与去污剂的共存性。Cel45A在一种常用洗涤剂C12-LAS中会失活。这是一种阴离子表面活化剂，解决酶活降低的方法是通过去除阳离子氨基酸或者引入阴离子。另外一种方法是通过改变底物粘合凹槽从而阻止LAS进入活性位点。总共有十六个位点被单独或者联合改变。这些变株被用于解开胍盐氯化物变性剂和阴离子折叠剂C12-LAS的折叠。尽管通过离子平衡状态下的简单二态模型发现Cel45A在胍盐氯化物变性剂中是伸展的，但是在重折叠过程中却有少量的中间产物的积累。七个二硫化物粘合并未测出在自然状态下的稳定性。Cel45A在C12-LAS低浓聚物中是展开的。通过分析16种Cel45A突变株，结果表明变性剂的展开状态与洗涤剂只有很微弱地联系。突变株与胍盐氯化物变性剂在折叠性上有很大的相似性：在C12-LAS的伸展态中大概有多于1000个折叠。资料支持了一个洗涤剂展开的简单模型，通过引入正电荷或者去除负电荷从而大大提升了酶对洗涤剂的敏感度。然而和疏水洗涤剂末端的相互作用促成了一个较小的延伸。这暗示着由三维结构中个别残基决定的不同洗涤剂介导的展开路径存在。双突变循环表明以胍盐氯化物变性剂的变性作用为测量基准发现两个近端残基的突变比独立突变所引起的斥力和去稳定作用比独立突变之和还要大，但酶C12-LAS亲和力也降低了，因而总体来说还是真正提高了酶在C12-LAS