几种常见柞树种质的dna提取

几种常见柞树种质的dna提取

橡胶树是贵族植物的总称。柞树不仅是发展柞蚕生产的基本生物资源,同时也是我国绿化荒山、涵养水源、防沙固林的优良树种,具有很高的生态与经济价值。为了研究柞树植物的遗传多样性和遗传分化,目前采用的重要手段是运用DNA分子标记技术,因此需要获得纯度较高的基因组DNA,以保证实验结果的可靠性和可重复性。由于辽东栎(Q.liaodunggensis)、蒙古栎(Q.mongoica)等柞树属多年生的木本植物,在提取基因组DNA时,较难去除植物体内含量较高的多糖和酚类等次生代谢物质,获得的基因组DNA产量低、质量差。提取植物基因组DNA的方法很多,最常见的提取方法是十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulphate,SDS)法和十六烷基三乙基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide,CTAB)法。多数植物应用这两种方法提取基因组DNA的质量均较好,但对一些特殊植物,其提取效果有明显的差异。本实验室曾以几种柞树植物的叶片为材料,采用常规的SDS和CTAB法均未获得可用于实验的理想柞树基因组DNA。为此,我们在提取柞树基因组DNA的实验中对CTAB法进行适当的改良,获得了质量较高的柞树基因组DNA。1材料和方法1.1其它试剂材料:辽东栎、蒙古栎、麻栎(Q.acutissima)和槲柞(Q.dentage)等柞树的叶片采自沈阳天柱山蚕场。CTAB提取液:100mmol/LTris-HCl(pH8.0),50mmol/LEDTA(pH8.0),1.4mol/LNaCl,质量分数为2%的CTAB,质量分数为2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP),体积分数为2%的β-巯基乙醇(用时加入)。其它试剂:V(氯仿)∶V(异戊醇)=24∶1混合液,V(酚)∶V(氯仿)∶V(异戊醇)=25∶24∶1混合液,预冷异丙醇,预冷无水乙醇,5mol/LNaCl;70%乙醇。仪器:高速冷冻离心机(德国产)、DYY-8B型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)、PTC-200PCR仪(美国PE公司)等。1.2dna的提取参照Doyle等提取基因组DNA的CTAB方法作适当改进。取柞树叶片与液氮共研成细粉,将粉末分装于1.5mL的Eppendorf管中,先迅速加入0.35倍体积的无水乙醇,颠倒数次,然后加入预热的2%CTAB提取液700μL,65℃水浴中保温30min,12000r/min离心5min;取上清液于另一只Eppendorf管中,加入等体积V(酚)∶V(氯仿)∶V(异戊醇)=25∶24∶1的混合液,12000r/min离心10min;取上清液于另一只Eppendorf管中,加入等体积的V(氯仿)∶V(异戊醇)=24∶1的混合液;将上清液移入1倍体积预冷的异丙醇,于-20℃静置至少40min,用小枪头轻轻挑出絮状DNA;收集沉淀,加入1mol/LNaCl400μL进行溶解;待沉淀溶解后,加入等体积的氯仿-异戊醇,12000r/min离心5min;取上清液,加入装有1/2体积的NaCl溶液和2～2.5倍体积预冷的无水乙醇,轻轻摇动至出现白色絮状沉淀;收集沉淀,加入100μL的70%乙醇冲洗2次去除乙醇,然后将DNA放在超净工作台上吹干;加入50μL含有10mg/mLRNA聚合酶的双蒸无菌水溶解DNA。1.3dna质量的检测用1%的琼脂糖凝胶电泳及EB(溴化乙啶)染色,检测提取基因组DNA的质量(电泳缓冲液为1×TBE,电压80V,电泳1～2h),然后在紫外凝胶成像系统下观察、成像。1.4dna纯度测定取DNA样品溶液用双蒸无菌水稀释,在紫外可见分光光度计上,测定在260nm和280nm波长下的吸收值,根据D260nm/D280nm判断DNA的纯度,计算D值,调整DNA的质量浓度至200～500ng/μL左右。1.5rapd反应程序反应体系为10μL,包括1μL10×Buffer、50ng模板DNA、0.2mmol/LdNTPs、1UTaq酶、0.5mmol/L正反引物、2.5mmol/LMg2+。SSR标记的正反引物为F:ACCGCCTATCTCAACCAGAG;B:GTCCGAGAATCATCATTAAAGG。RAPD标记采用随机引物。反应程序为:94℃预变性4min;94℃1min,58℃2min,72℃1min,共36个循环;最后72℃延伸10min,4℃保存。对PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳进行检测效果,在紫外凝胶成像系统下观察成像。2结果与分析2.1dna纯度用改进的CTAB法提取几种柞树基因组DNA,结果表明:所提取的DNA沉淀为白色,干后透明,电泳时,点样孔不发亮,DNA主带清晰,无弥散带,无明显的RNA带,说明采用改进后的CTAB法提取柞树的基因组DNA可以很好地去除提取液中的RNA、蛋白质、多糖以及其它次生代谢物质,获得的DNA纯度较高(图1)。2.2分光光度计上的检验结果将提取的柞树基因组DNA的在紫外可见分光光度计上的分析结果如表1所示,D260nm/D280nm值为≥1.75,说明提取质量较好。2.3dna质量分析图2为柞树基因组DNA的SSR扩增结果。从图2中可以看出,采用经过改进的CTAB法所获得的DNA质量较高,完全适合于分子生物学的研究。3dna的提取本实验室采用常规CTAB法提取的柞树DNA颜色为棕褐色,说明含有较多的多酚类物质。改进的CTAB法提取液中不仅加入了β-巯基乙醇还加入PVP。β-巯基乙醇能够有效防止多酚类物质的氧化。PVP是一种交联结构高分子量物质,其分子具有的酰胺键可吸附多酚分子上的氢键,形成水不溶性复合物。此外,常规CTAB法所提取的柞树基因组DNA还会被胶冻状物质包裹不易分离,因此无法进行后续的研究。采用改进CTAB法所提取的DNA沉淀基本上为白色,干后为无色透明。经本实验改进的CTAB法与原CTAB法相比有以下几个不同点:首先是在研磨后先加入0.35倍上清液体积的无水乙醇,迅速混匀,使多糖先沉淀;然后在改进的操作步骤中先加入0.6～1倍上清液体积的异丙醇来获取可见的絮状DNA,并挑出沉淀,这样可以去除