食品卫生微生物学

食品卫生微生物学检验微生物学检验的范围1.生产环境的检验2.原辅料的检验3.食品加工，储存，销售环节的检验4.食品的检验食品卫生与微生物1.食品中微生物的污染源 水、空气、土壤、人和动植物2.食品中微生物污染途径通过水而污染〔主要途径〕通过空气而污染通过人及动物而污染〔人的手、工作服〕通过用具及杂物而污染食品卫生与微生物3.与食品有关的微生物

细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、食用菌、病毒等六大类。4.食品变质与微生物防止食品腐败变质最重要的措施是尽可能减少微生物污染和抑制微生物的生长繁殖，其次是对食品采取抑菌或灭菌的方法，控制食品腐败变质

食品卫生与微生物食品被微生物污染后对人体的危害可分为三种：细菌性食物中毒〔常见的食物中毒〕、真菌性食物中毒、消化道传染病。各种致病菌引起人类病症如下： 沙门氏菌：主要有伤寒，食物中毒和败血症等等。〔急性胃肠炎病症〕 金黄色葡萄球菌：侵入人体伤口会产生化脓性感染，恶心、屡次呕吐、腹痛。 致病性大肠杆菌：腹泻食品微生物控制标准及指标1.食品微生物检测指标常规检测工程：1〕.细菌总数、2〕.大肠菌群、3〕致病菌：金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌非常规检测工程：副溶血孤菌、李氏特菌、霉菌、酵母菌等2食品卫生质量标准 细菌总数为？个/克以下，大肠菌群≤MPN，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌都为阴性。微生物学检验方法1.显微镜检验〔染色法〕2.别离纯培养检验3.生化试验4.血清学检验5.动物试验食品卫生微生物国家标准中华人民共和国国家标准GB/T4789.1-2003～GB/T4789.35-2003?食品卫生微生物学检验?总计包括总那么、菌落总数测定、大肠菌群测定、〔沙门、志贺、铜绿、金葡、溶血性链球菌〕等控制菌测定检验，各种食品检验标准等共34个标准。食品卫生微生物学检验总那么GB-T4789.1-2021食品卫生微生物学检验菌落总数测定GB-T4789.2-2021食品卫生微生物学检验大肠菌群测定GB-T4789.3-20214.食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验GB-T4789.4-20215.食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验GB-T4789.5-2003;6.食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验GB-T4789.6-20037.食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验gbt4789.07-20218.食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验gbt4789.08-20219.食品卫生微生物学检验空肠弯曲菌检验gbt4789.09-202110.食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验GB-T4789.10-202111.食品卫生微生物学检验溶血性链球菌检验_gbt4789.11-200312.食品卫生微生物学检验肉毒梭菌及肉毒菌素检验gbt4789.12-200313.食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌检验_gbt4789.13-200314.食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验_gbt4789.14-200315.食品卫生微生物学检验霉菌和酵母计数GB-T4789.15-202116.食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定_gbt4789.16-200317.食品卫生微生物学检验肉与肉制品检验_gbt4789.17-200318.食品卫生微生物学检验乳及乳制品检验_gbt4789.18-202119.食品卫生微生物学检验蛋与蛋制品检验_gbt4789.19-200320.食品卫生微生物学检验水产食品检验_gbt4789.20-200321.食品卫生微生物学检验冷冻饮品、饮料检验_gbt4789.21-200322.食品卫生微生物学检验调味品检验_gbt4789.22-200323.食品卫生微生物学检验冷食菜、豆制品检验_gbt4789.23-200324.食品卫生微生物学检验糖果、糕点、蜜饯检验_gbt4789.24-200325.食品卫生微生物学检验酒类检验_gbt4789.25-200326.食品卫生微生物学检验罐头食品商业无菌的检验gbt4789.26-200327.食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留量的检验gbt4789.27-200328.食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂

GB-T4789.28-200329.食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌本酵米面亚种检验_gbt4789.29-200330.食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验_gbt4789.30-200331.食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌、和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体检验_gbt4789.31-200332.食品卫生微生物学检验大肠菌群的快速检测

GB－T4789.32200332.食品卫生微生物学检验粮谷果蔬类食品检验

GB－T4789.332003食品和药品微生物学检验比较1.食品检验工程多，有15种控制菌检验工程，药品较少，常规就4种。2.现在药品微生物检验一般要做方法学验证，而食品不用。3.食品控制菌检查不需做阳性对照，而药品要做4.食品检验程序较复杂，如沙门，大肠埃希氏菌要做分型到亚属的检查，而药品相对要简单5.供试品制备，食品一般取25g或25ml到225ml进行稀释，而药品取10g或10ml定容到100ml。粮谷、果蔬类食品检验-33

糖果、糕点、蜜饯检验_24检验工程：1.菌落总数测定GB-T4789.2-20032.大肠菌群测定GB-T4789.3-20033.沙门氏菌检验GB-T4789.4-20034.志贺氏菌检验GB-T4789.5-20035.金黄色葡萄球菌检验GB-T4789.10-2003;6.霉菌和酵母计数GB-T4789.15-2003乳及乳制品检验_18

蛋与蛋制品检验.19检验工程：1.菌落总数测定GB-T4789.2-20032.大肠菌群测定GB-T4789.3-20033.沙门氏菌检验GB-T4789.4-20034.志贺氏菌检验GB-T4789.5-20035.金黄色葡萄球菌检验GB-T4789.10-2003;6.霉菌和酵母计数GB-T4789.15-20037.乳酸菌饮料中乳酸菌检验GB-T16347

肉与肉制品检验-17

冷食菜、豆制品检验-23检验工程：1.菌落总数测定GB-T4789.2-20032.大肠菌群测定GB-T4789.3-20033.沙门氏菌检验GB-T4789.4-20034.志贺氏菌检验GB-T4789.5-20035.金黄色葡萄球菌检验GB-T4789.10-2003;食品样品的采集〔一〕采样目的确保采集的样品能代表全部被检验的物质，使检验分析更具代表性。〔二〕采样原那么1.采集的样品要有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在，同时能反映全部被检食品的组成、质量和卫生状况。2.应设法保持样品原有微生物状况，在进行检验前不得污染，不发生变化。3.采样必须遵循无菌操作程序，容器必须灭菌，防止环境中微生物污染采样数量和方法〔三〕采样数量取样数量确实定，应考虑分析工程的要求、分析方法的要求及被检物的均匀程度三个因素。样品应一式三份，分别供检验、复检及备查使用，每份样品数量一般不少于200g。根据不同种类采样数量略有不同，实验室检验样品一般为25克。〔四〕采样方法1．采取随机抽样的方式。2．直接食用的小包装食品，尽可能取原包装，直到检验前不要开封，以防污染。3．如为非冷藏易腐食品，应迅速将所采样品冷却至0－4℃。4．不要使样品过度潮湿，以防食品中固有的细菌增殖。5．在将冷冻食品送到实验室前，要始终保持样品处于冷冻状态。样品一旦融化，不可使其再冻，保持冷却即可。〔五〕样品的保存和运送1．样品采集完后，应迅速送往实验室检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1－5℃环境中，如需冷冻者，那么在冷冻状态下送检。2．冷冻样品应存放在－15℃以下冰箱内；冷却和易腐食品应存放在0－5℃冰箱或冷却库内；其它食品可放在常温冷暗处。3．运送冷冻和易腐食品应在包装容器内加适量的冷却剂或冷冻剂。保证途中样品不升温或不融化。4．待检样品存放时间一般不应超过36小时。二、检验样品的制备〔一〕样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。〔二〕检验冷冻样品前应先使其融化。可在0－4℃融化，时间不超过18小时，也可在温度不超过45℃的环境中融化，时间不超过15分钟。〔三〕检验液体或半固体样品前应先将其充分摇匀。如容器已装满，可迅速翻转25次；如未装满，可于7s内以30cm的幅度摇动25次。从混样到检验间隔时间不应超过3min。(四)开启样品包装前，先将外表擦干净，然后用75％乙醇消毒开启部位及其周围。1．非粘性液体样品可用吸管吸取一定量，然后参加适量的稀释液或培养基内，吸管插入样品内的深度不应超过2.5cm,也不得将吸有样品的吸管浸入稀释液或培养基内。2．粘性液体样品可用灭菌容器称取一定量，然后参加适量的稀释液或培养基。3.固体或半固体样品可用灭菌的均质杯称取一定量，再加适量的稀释液或培养基进行均质，从样品的均质到稀释和接种，相隔时间不应超过15分钟。三、检验〔一〕实验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验，检验过程中要认真、负责，严格进行无菌操作，防止环境中微生物污染。〔二〕检验所使用的稀释液、试剂、培养基接触的一切器皿必须经过有效的灭菌。〔三〕实验室所用仪器、设备的性能应定期检查和校正。〔四〕制备试剂和培养基所用的水，应为无离子水或用玻璃器皿蒸馏的蒸馏水。〔五〕检验结束后，所有带菌的培养基、试剂、稀释液和器皿必须尽快灭菌和洗刷。清洗过的器皿不应残留洗涤剂的痕迹菌落总数检验根本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。〔选取菌落数在30~300之间的平板〕差异：1.样品的处理和稀释：操作方法：以无菌操作取检样25g〔或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。2.培养温度：36℃±1取10克或10毫升加生理盐水90/100ml(稀释10倍:10-1)取1毫升取1毫升装9毫升生理盐水试管装9毫升生理盐水试管稀释100倍:10-2稀释1000倍:10-3取1毫升培养皿最少2个最小包装再倒15毫升培养基培养基(营养琼脂)取1毫升再倒15毫升培养基取1毫升再倒15毫升培养基培养(30-35℃,48小时)阴性对照生理盐水取1毫升再倒15毫升培养基某口服液微生物限度检查记录1稀释度平皿10-110-210-3阴性对均6350计算结果6.3*102cfu/ml标准规定不超过1000cfu/ml报告符合规定微生物限度检查记录2稀释度平皿10-110-210-3阴性对照1不2163602不26043平均不23840计算40×103/238*102＝1.7结果2.5*104cfu/ml标准规定不超过1000cfu/ml报告不符合规定微生物限度检查记录3稀释度平皿10-110-210-3阴性对照110645402107356平均107405计算结果1.3×103.cfu/ml标准规定不超过1000cfu/ml报告不符合规定细菌报告规那么举例

10-1

10-2

10-3阴性对照比值菌落数不可计

164

20

0-16400不可计

2954601.5537750不可计

271

6002.21271002392023501.73不可计不可3150不可计30512

024191202400000<10液体微生物限度检查接种

1、样品稀释：1〕用移液管取25ml供试品，于250ml烧杯中，参加225ml生理盐水，边加边搅拌使溶解均匀。为10-1供试液。2〕用移液管取9ml生理盐水于大试管中，用移液管取1ml10-1供试液参加同一试管，吹吸均匀，为10-2稀释液。3〕同法，由10-2稀释液获得10-3稀释液。评分要点：1.

无菌操作前后酒精擦手擦台面离酒精灯太远烧瓶口2.移液管吸耳球正确使用3.样品稀释梯度正确，混匀4.先稀释，后加样5.其它酌情扣分，结果不出现负分接种1〕细菌：三个稀释级，每个稀释级别接种2~3皿，每皿接种1ml，对照接种生理盐水1ml。每皿参加营养琼脂约15mL，摇匀，放冷，36℃倒置培养。本卷须知：无菌操作培养基温度，拿平皿姿势，摇匀平皿倒平板，空白对照。霉菌和酵母菌及其检验与菌落总数的测定方法根本相似。主要步骤为：将样品制作成10倍梯度的稀释液，选择3个适宜的稀释度，吸取1ml于平皿，倾注培养基后，培养观察，计数。差异：1.培养基：孟加拉红〔虎红〕培养基2.培养温度25~28℃，时间5d观察结果3.计数：选取菌落数15~150cfu之间的平板大肠菌群定义大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致.其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群检验2003

国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、别离培养和证实试验。1.乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。2.别离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。3.证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。4.报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml〔g〕大肠菌群的MPN值。大肠菌群MPN计数20211.样品稀释：依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。2.初发酵试验:

选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨〔LST〕肉汤，每管接种1ml,36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者那么进行复发酵试验。3.复发酵试验

用接种环从发酵产气的LST肉汤管中取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐(BGLB〕肉汤管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。

4.大肠菌群最可能数〔MPN〕的报告

根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表〔见附录B)，报告每克〔或毫升〕样品中大肠菌群的MPN值。饮用水大肠菌群复发酵培养结果观察与判定2〕MPN检索结果及单位换算：

3〕标准规定：4〕结论：稀释级别101010空白管号123123123结果其他(核酸杂交技术、PCR技术、气液相色谱法、噬菌体分型、细菌素分型、质粒指纹图谱法)细菌的扩增别离培养涂片镜检生化试验血清学试验致病菌检查：沙门氏菌致病性沙门氏菌胃肠炎，潜伏期一般6-72小时，主要病症为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛。病程一般1-2天或更长。感染剂量为15-20个菌，死亡率达1-4%。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。污染源主要是人和家畜的粪便，沙门氏菌常存在于动物中，特别是禽类和猪。在许多环境中也有存在。从水，土壤，昆虫中，从工厂和厨房设施的外表和动物粪便中已发现该类细菌。它们可以存在于多类食品中，包括生肉，禽，奶制品和蛋，鱼，虾和田鸡腿，酵母，椰子，酱油和沙拉调料，蛋糕粉，奶油夹心甜点，顶端配料，干明胶，花生露，橙汁，可可和巧克力。沙门氏菌属简介沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现2000多个血清型，我国已发现血清型近200个。沙门氏菌属——生物学特性形态特征：革兰氏阴性，大小为1~3×0.4~0.9μm的两端钝圆的短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，运动力强。培养特性：沙门氏菌需氧或兼性厌氧，10～42℃都可生长，最适生长温度为37℃，最适pH为6.8～7.8。营养琼脂平板上：35～37℃培养18~24h，其菌落大小一般为2～3mm，光滑、湿润、无色、半透明、边缘整齐。血平板上：中等大小的灰白色菌落。生化特性：绝大多数沙门氏菌有规律的发酵葡萄糖产酸产气，但也有不产气者，不发酵蔗糖和侧金盏花醇、不产生吲哚、不分解尿素。沙门氏菌属——生物学特性沙门氏菌的检验1.前增菌：缓冲蛋白胨水〔BP〕、2.选择性增菌：四硫酸钠煌绿〔TTB〕增菌液、亚硒酸盐胱氨酸〔SC〕增菌液3.选择性平板别离：亚硫酸铋琼脂〔BS〕，HE琼脂4.生物化学筛选-5.血清学鉴定3、生化试验自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂、蛋白陈水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱竣酶试验培养基及对照培养基各1管，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按生化反响初步鉴定表判定结果。按反响序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1，其他5种反响结果均可以排除。在TSI琼脂中，典型的沙门氏菌培养物使斜面呈碱性〔红色〕，底层呈酸性〔黄色〕，产生或不产生H2S〔琼脂变黑色〕。沙门菌在TSI琼脂上的反响金黄色葡萄球菌及检验金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的时机很多在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大那么更多，占45%。季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。金黄色葡萄球菌生物学特性典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃，最适生长pH7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气细菌的扩增：别离培养涂片镜检生化试验取营养培养基3瓶，每瓶各100ml

甘露醇氯化钠琼脂平板36±1℃培养18～24h

无可疑菌落未检出/g有可疑菌落营养琼脂斜面血浆凝固酶试验金黄色葡萄球菌的检验1.样品处理：无菌取25g或25mL食品样品，放入225mL灭菌生理盐水中均质，制成10-1稀释液。2.增菌培养：将10-1稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37°C培养24小时。3.别离培养：将上述稀释液或培养液分别划线血平板和Baird-Parker平板，置37°C培养24-48小时。金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，外表光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落为圆形，直径2-3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带。4.染色观察：挑取可疑性菌落进行革兰氏染色5.血浆凝固酶试验金黄色葡萄球菌的单个菌落在Baird-Parker琼脂平板上呈圆形,外表光滑、凸起、湿润,直径2～3mm。灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。志贺氏菌属及检验志贺氏菌属的细菌〔通称痢疾杆菌〕，是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾病症的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、