双酚a对微小小环藻的急性毒性效应

双酚a对微小小环藻的急性毒性效应

双酚a（bipsiea）的学名是氨基二苯基丙烯酸酯（c15h16a2）。这是生产环氧树脂（ep）树脂、酚醛树脂、可塑性聚吡咯烷、抗氧剂和氯氯醚（pvc）稳定性的前体材料。广泛应用于会计核算行业，如包装甲、袋装甲、牙科填充剂、婴儿瓶等。双酚A具有雌激素活性,可干扰人体内分泌系统。美国环境保护局1997年公布的内分泌干扰物名单中双酚A被列为可疑内分泌干扰物。1998年日本在河川、湖泊、地下水及封闭性海域等调查地点检出频率较高的内分泌干扰物质中就包括双酚A。当水体中双酚A浓度达到1μg/L,即可引起腹足类Nucellalapillus雄性个体雌性化。随着工业和经济的发展,双酚A的生产和使用大量增加,全球双酚A使用量已超过200万t,其最终归宿是由各种途径进入水体,并可通过食物链作用在水生生态系统中进行传递,对水生生物产生内分泌干扰作用。目前,国内外双酚A对水生生物的毒理和毒性作用研究不多。深圳湾福田红树林保护区是我国国家级自然保护区,生物多样性十分丰富,但其水域中双酚A含量已达对水生生物有所影响的浓度。本文通过研究双酚A对红树林优势藻种的生态毒理效应,来了解双酚A对红树林水生生物的潜在危害。1材料和方法1.1实验仪器及设备双酚A购自美国Sigma-Aldrich公司,以甲醇为溶剂配成10000mg/L的母液,实验时再以甲醇稀释成所需浓度。实验中所用仪器有显微镜(OLYMPUSCX31)、制冰机(SCOTSMANAF100)、分光光度计(HITACHIU-1800)、高速离心机(AnkeTGL-16G)、数码相机(NIKONCOOLPLAX4500)、MGC-300B型光照培养箱、WSZ-200A型摇床、XW-80A型旋涡混合器、血球计数板、高压灭菌锅、三角瓶等。1.2藻种的生长caspia从福田红树林近岸水域中分离纯化优势藻种微小小环藻(Cyclotellacaspia),在无菌条件下以人工海水配制的f/2培养基于光照培养箱中培养作为本研究实验藻种。培养条件为:温度26℃;光强4000lx,光暗比12h∶12h。藻细胞初始接种密度为1.32×104个/mL。1.3海藻密度的测定移取0.1mL藻液于血球计数板上,在100倍显微镜下进行计数。1.4不可见效应浓度以不同浓度甲醇处理微小小环藻,96h后在显微镜下计数。与对照组无显著性差异的最高浓度可定为甲醇的不可见效应浓度(noobservedeffectconcentration,NOEC)。1.5生长抑制率测定根据生长速率μ公式计算藻细胞生长速率,根据Iμi公式计算生长抑制率。将双酚A浓度与生长抑制率进行一元线性回归,得到双酚A对微小小环藻的半效应浓度(EC50)。1.6测定了蓝色信号的含量采用ISO10260乙醇提取法进行叶绿素a含量测定。1.7内膜系统结构的破坏逆境胁迫下生物体内O2-·、H2O2、·OH等活性氧会大量增加,它可引起质膜和内膜系统结构的破坏和功能的丧失,甚至导致细胞的死亡。生物体在长期进化过程中发展了抗氧化防御系统,SOD是抗氧化防御系统中清除超氧阴离子自由基(O−⋅22-⋅)的关键酶,SOD活性可作为解释生物对逆境胁迫耐受力和污染物对生物致毒机理的指标。(1)粗酶溶液的制备离心法收集藻细胞,加入磷酸缓冲液和少量石英砂在冰浴中研磨,匀浆液冷冻离心,上清液即为粗酶提取液。(2)可溶性固形物含量的测定采用考马斯亮蓝法测定,以小牛血清蛋白作标准曲线。(3)氮蓝四唑nbt的光化学还原反应法采用Beauchamp建立,Bewley等改进的氮蓝四唑(NBT)光化学还原反应法测定,以单位时间内NBT还原反应速度被SOD抑制50%所需酶量为一个酶活力单位(u·mg-1·min-1)。1.8细胞形态的观察显微镜(400×)下观察藻细胞形态的变化,用测微尺测量藻细胞环面与壳面的尺寸,并进行显微拍照记录藻在各浓度双酚A作用下的形态变化。2结果与讨论2.1小环藻的急性毒性实验通过实验得到甲醇NOEC值为0.5%,双酚A96h-EC50值为8.30mg/L。以96h-EC50值为中心浓度,设4,6,8,10和12mg/L双酚A进行微小小环藻急性毒性实验。微小小环藻的生长曲线见图1。由图1可以看出,双酚A对藻细胞生长产生不同程度的抑制作用,且抑制程度与双酚A浓度显示出明显的剂量-效应相关性。4~6mg/L双酚A使藻细胞增长较对照组缓慢,生长周期延长;8~10mg/L双酚A对藻细胞生长产生明显抑制作用,并使其生长周期缩短;当双酚A浓度高于10mg/L时,藻细胞几乎停止生长。2.2藻细胞密度和叶绿素a含量的变化如图2所示,随着双酚A浓度的增大,微小小环藻的叶绿素a含量逐渐降低,并且其含量变化与藻细胞密度变化呈一定相关。叶绿素a含量降低可能与活性氧的伤害有关。在双酚A胁迫下,叶绿体产生的有害活性氧不能及时清除,使叶绿体膜受到氧化,基质外漏,叶绿体代谢紊乱功能失常,从而导致叶绿素a含量降低。2.3藻细胞抗氧化酶活性不同浓度双酚A胁迫下,微小小环藻SOD活性变化具有一定规律性(见图3)。对照组SOD活性处于最低水平并且保持稳定;处理组SOD活性基本呈现出先上升,随着培养时间的延长再下降并趋于平稳的趋势。不同浓度双酚A对藻SOD活性的影响主要表现出从诱导到抑制的动态过程,这一现象与刘志礼等在研究NaCl胁迫对螺旋藻生长及抗氧化酶活性的影响所得结果相似。4d时,随双酚A浓度增加,藻细胞SOD受到诱导活性逐渐升高以提高超氧阴离子自由基的清除能力。继续增大双酚A浓度,SOD活性受到抑制,但仍较对照组高。10mg/L处理组SOD活性处于最高水平,较对照组升高了362%。4、6、8、12mg/L处理组SOD活性分别较对照组升高125%、166%、325%、263%。8d时,10mg/L处理组SOD活性仍处于最高水平,较对照组高出300%。然而12mg/L处理组SOD活性大幅度下降,比对照组还低。随培养时间延长,低浓度处理组藻细胞中活性氧得到有效地清除,故其SOD活性降到了对照组水平;高浓度处理组SOD活性大幅降低可能是由于藻细胞中活性氧产生与清除的动态平衡状态受到严重破坏,过量活性氧对SOD活性产生抑制。12mg/L处理组中,藻细胞内活性氧已严重超过了抗氧化防御系统的处理能力,完全抑制其SOD活性,故在后3次监测中均测不到该处理组SOD活性。2.4小小环藻细胞形态的影响正常生长情况下,微小小环藻呈短圆柱体状,环面为四方形(长12.25μm,宽9.80μm),壳面为圆形(直径9.80μm)。不同浓度双酚A对微小小环藻细胞形态的影响见图4。由图4可看出,对照组中微小小环藻处于正常分裂状态,其叶绿体较多地环绕细胞壁分布。4和6mg/L处理组(b,c)中藻细胞形态变化不大。8和10mg/L处理组(d,e)中藻细胞生长受到严重抑制,细胞器结构受到破坏,细胞分裂增殖速度减慢,出现了很多明显拉长的藻细胞。12mg/L处理组(f)中藻细胞几乎停止生长,细胞颜色变淡,部分细胞还出现较大的空白区和大小不一的球状颗粒,这些球状颗粒可能是过氧化物酶体或脂肪粒。3藻细胞抗氧化活性的变化(1)双酚A对微小小环藻的96h-EC50为8.30mg/L,属于高毒类有机化合物。(2)双酚A对藻生长的抑制程度随其浓度增加而加强,浓度超过10mg/L时,微小小环藻几乎完全停止生长。(3)藻细胞叶绿素a含量随双酚A浓度的增加而下降,表现出良好的剂量-效应关系。(4)藻SOD活性随着双酚A浓度和作用时间发生明显的变化,总体表现为从诱导到抑制的动态过程。藻生长初期,4~10mg/L双酚A使藻细胞内抗氧化防御系统被诱导,SOD活性表现出应激性上升并具有较好的剂量-效应关系;12mg/L双酚A则明显抑制其SOD活性。由此可见,SOD活性可从分子水平上反应双酚A对藻细胞的早期影响,是较灵敏的生化指标之一,可做为生物标志物(biomarker)用于监测双酚A对水生生态系统的影响。(5)不同浓度的双酚A对藻细胞