血虫草血根碱对钉螺头足部丙二醛的影响

血虫草血根碱对钉螺头足部丙二醛的影响

用于植物血草素的生物化合物（eca）具有杀死螺旋性杀死螺钉的作用。根据研究，即使ea在低质量上具有显著的杀螺效果，也能有效抑制螺钉螺旋的向上生长和螺蛋的繁殖，并且cea对鱼类的毒性较低。因此，ae被认为是理想的植物杀螺剂。ECA是由多种生物碱组成,主要成分包括:白屈菜红碱(Chelerythrine)、血根碱(Sanguinarine)、原阿片碱(Protopine)、α-别隐品碱(α-allocyptopine)、白屈菜红默碱(chelerythridimerine)和氧化血根碱(oxysanguinarine).为了进一步确定ECA中杀灭钉螺的有效成分,笔者从血水草中分离出了血根碱(Sanguinarine,SAN),并在室内进行浸泡杀螺试验,探讨血根碱杀灭钉螺的效果及有效质量浓度,检测血根碱药物对钉螺头足部丙二醛(malondialdehyde,MDA)活性的影响,为探讨血根碱杀灭钉螺的机理提供基础数据,为血水草资源保护与开发、生态型绿色药物的开发与利用提供科学依据.1材料表面1.1血根碱的分离纯化秋季自湖南桃江县人形山采集新鲜血水草根及根茎,洗净、晾干,干燥后碾成粗末,用1%盐酸水溶液渗漏提取,渗漏液经大孔吸附树脂柱吸附,依次用20%、60%、90%的甲醇水溶液、100%的乙醇溶液洗脱并浓缩,重结晶,从血水草中分离出血根碱.测定所得到的产品质谱图与标准图谱对照进行鉴定,制备纯度为98%以上的血根碱供试验用.本实验用血根碱含量为98.3%.1.2湖北钉螺实验方法在试验前1d从岳阳君山流行区采回钉螺,为具有肋壳的湖北钉螺(OncomelaniahupensisGredler.),置实验室过夜,实验当日选活钉螺进行实验.1.3为标准偏差试验试剂盒试剂盒由南京建成生物工程研究所第一分所生产提供(批号20080115).1.4仪器和实验仪器仪器主要有H721B可见分光光度计(天津市普瑞斯仪器有限公司)、高速冷冻离心机5804R(德国EPPENDORF)、AUW120D电子分析天平(日本岛津公司)及SHP-250生化培养箱(上海精宏仪器公司).2方法2.1钉螺的浸泡杀活试验按WHO的“杀螺剂实验室终筛方法”中的浸泡法进行.配置8个质量浓度组的血根碱水溶液:50、25、12.50、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.390625mg/L,以除去氯的自来水作为对照.每1000mL溶液中放入活螺100只,每组配置2000mL药液,投入活螺200只,在温度25℃条件下进行室内浸泡杀螺试验.分别在浸泡24、48、72、96h后中各随机取出钉螺50只,清水洗净,在室温下晾放72h,用水测法及敲击法鉴定钉螺的死活,并记录,计算每个质量浓度组钉螺的死亡数和死亡率.2.2为测定螺钉头足部的mda含量2.2.1钉螺组织病理学检测用水测法选取2个质量浓度组(12.50、6.25mg/L)的血根碱浸泡48h存活的钉螺,按李赋京解剖法小心剥取钉螺头足部,加预冷的0.2mol/LpH值为7.1磷酸缓冲液(按钉螺头足部重量与缓冲液1∶9比例)分别制样,每样各取30只钉螺头足部组织,冰浴匀浆,在0～4℃条件下离心(15min,6500r/min),取上清液作为待测液.2.2.2标准结果的计算选用南京建成生物工程研究生产的MDA测试盒,按实验要求依次加样操作,每样做2只平行管,并按下列公式计算出各实验结果:CMDA=L−L0S−S0×C0C.CΜDA=L-L0S-S0×C0C.式中:CMDA为MDA的含量(nmol/mg);L为测定管吸光度;L0为测定空白管吸光度;S为标准管吸光度;S0为标准管空白吸光度;C0为标准品质量浓度(10nmol/mL);C为蛋白含量(mg/mL).2.2.3处理数据各处理组之间的差异运用SPSS17.0软件进行Dunnett-t检验分析.3结果与分析3.1血根碱在质量浓度和浓度下钉螺的急性毒性发挥的结果如表1所示,浸泡时间相同,随着血根碱质量浓度的升高,钉螺的死亡数和死亡率也随之明显增高.在较高血根碱质量浓度下,在24h内就可以杀灭大部分的钉螺.如在50mg/L高质量浓度下,钉螺死亡数和死亡率分别达到了26只和52%;25mg/L较高质量浓度下,钉螺死亡数和死亡率分别达到了22只和44%;12.50mg/L中高质量浓度下,钉螺死亡数和死亡率分别达到了21只和42%.随着时间的推移,经两组不同质量浓度50和25mg/L浸泡72h后,50只钉螺均完全死亡,死亡率均达到100%,表明血根碱具有杀灭钉螺的作用,而且在高质量浓度下,灭螺时间明显缩短.由表1还可以看出,在3.125和1.5625mg/L质量浓度下,经浸泡96h后,钉螺的死亡率也分别可达到98%和92%;在0.78125和0.390625mg/L质量浓度下,经浸泡96h后,钉螺的死亡率也分别可达到92%和88%;在6.25mg/L质量浓度下,浸泡72h后,钉螺的死亡率90%,经浸泡96h后,死亡率可达98%.可见在低质量浓度下,血根碱也具有明显杀灭钉螺的效果.3.2钉螺头足部mda活性测定研究指出,测试MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度,间接地反映出细胞损伤的程度及机体衰老的程度.为了比较不同质量浓度血根碱对钉螺头足部MDA活性的影响,本研究对12.500和6.250mg/L不同质量浓度血根碱在浸泡温度为25℃情况下,钉螺头足部MDA活性进行测定,结果如表2所示.经处理48h后的钉螺头足部的MDA含量均比对照组(去除氯自来水)显著(p<0.05)或极显著下降(p<0.01),其中12.50mg/L组MDA含量比对照组下降了14.19%,6.25mg/L组下降了36.06%.4血水草血根碱作养螺剂的作用机理药用植物杀螺剂具有就地取材、易被生物所降解、对环境不造成污染和毒害作用、节省费用、资源分布广泛等优点而成为药物灭螺研究的重要内容.国内外研究的植物杀螺剂的有效成分属于脂肪族酰胺、链烷醇、烯基酚、呋喃豆香素、黄酮及鱼酮、倍半萜双萜及皂素等8个化学大类.研究表明,血水草生物碱具有明显的杀螺作用,为药用植物杀螺剂的开发利用研究开辟了一类新的杀螺剂.血根碱是血水草生物碱的主要化学成分之一,为天然植物来源的生物碱,属异喹啉类生物碱(IsoquinolineAlkaloids)中苯骈菲啶(Benzophenanthrdine)型生物碱.血根碱具有广泛的生物学活性,具有更高、更强的抗细菌、抗真菌、消炎、抗氧化作用.本研究表明血水草血根碱不仅能杀灭钉螺,而且在低质量浓度下对钉螺具有明显的杀灭作用,杀螺效果随着药物浸泡时间的延长、药物质量浓度的升高而增强.因此,可认为血根碱是植物血水草杀螺剂的有效杀螺的化学成分.MDA是脂质过氧化物的最终产物之一,有机体在代谢过程中产生一定量的自由基,能攻击生物膜中的多种不饱和脂肪酸,引发脂质过氧化作用,使组织细胞受损伤,过氧化的脂质能分解并产生MDA.钉螺头足部由位于软体前端的头部和其腹面的足部组成,头部具有嘴、一对触角、一对眼,足