太湖蓝藻水华期间微囊藻种群丰度研究

太湖蓝藻水华期间微囊藻种群丰度研究

1实时荧光定量pcr技术微囊藻是湖泊富营养化湖泊形成水华最常见的优势种群之一，在许多微囊藻中可以产生微囊藻毒素（sivonintal.，1999）。研究表明，在淡水生态系统中，有毒微囊藻和非保护区藻类的丰度随时间的推移而变化。两种资源的丰度及其比例关系具有空间变化的特点（汤加尔纳尔.2003；rinta-kanta-2005；yoshida等人研究了mikata湖泊中的毒微囊藻和非毒微囊藻的丰度。结果表明，当沉积物微囊藻和沉积物微囊藻的丰度随时间的推移而变化时，沉积物微囊藻的丰度为0.5%-35%（yoshidatal.，2007）。沉积物微囊藻的丰度直接决定了沉积物微囊藻的毒性，是评估蓝藻水华生态风险的重要指标之一。一般来说，湖泊中的绿藻水华通常有几种微藻。不同类型微藻是否具有特定的细菌特征。同一物种的产毒率也与微囊藻的大小有关（chenetal.2009；simarketal.2004）。这为用传统的微观察法研究湖泊中的毒微囊藻和非毒微囊藻物种带来了许多困难。近年来，实时荧光定量pcr技术被广泛应用于蓝藻水华研究（rina-kantotal.，2005；dy藻体al.，2008；schoberetal.，2007）。根据特定的设计指南，可以量化蓝藻水华样品中的绿藻、微藻和微藻。与显微的观点相比，qpcr具有高度灵活动性和连续性的优势（zhangetal.2006）。同时，它不受样品形状的限制，而是在水和土壤样本中研究目标生物。太湖是我国第三大淡水湖泊,面积2338km2,平均水深1.89m,是个典型的浅水湖泊.太湖位于经济发达的长江三角洲地区,是该区域工农业用水的主要水源地,同时具有养殖、航运和旅游功能.随着太湖富营养化水平加重,夏季蓝藻水华发生已成常态化.微囊藻是太湖蓝藻水华的优势种群,其生物量可占藻类总生物量90%以上(Chenetal.,2003).基于显微观察法和色素定量法对太湖水体和底泥中微囊藻种群分布已有研究(Songetal.,2007;Jietal.,2009).施丽梅等利用QPCR技术研究了梅梁湾水体中产毒微囊藻种群丰度随时间变化的规律(施丽梅等,2009).本文利用实时荧光定量PCR技术,分别以微囊藻毒素合成基因mcyA和藻蓝蛋白转录转录间隔区(PC-IGS)为研究对象,对太湖蓝藻水华期间不同湖区微囊藻种群丰度及其组成进行研究,以揭示湖泊富营养化水平对产毒微囊藻与非产毒微囊藻种群分布的影响.2材料和方法表面活性剂2.1样品采集和处理根据太湖富营养化程度和夏季蓝藻分布规律,结合课题需要,我们共设置了4个采样点(图1).梅梁湾(N2)、竺山湾(N5)、贡湖湾(N4)和湖心(S4).梅梁湾和竺山湾属于重富营养化湖区,贡湖湾和湖心属于中度富营养化湖区.2009年8月中旬微囊藻水华期间采集样品,为了保证采样点准确性,采用GPS定位系统.用2.5m长的PVC管采集整水柱,均匀混合.同时用多功能水质参数仪(YSI6600-V2,YellowSpringInstruments,USA)原位测定水体理化参数,包括溶解氧、电导率、浊度、水温、pH等.柱状采泥样器同步采集表层底泥(0～3cm).每个采样点采集6个样品,混合均匀,置于4℃黑暗保存.所有样品均在4h内带回实验室处理.2.2总氮和总磷GF/C玻璃纤维滤膜过滤50mL水样,滤液用Skalar自动分析系统测定水体中氨态氮(NH+4-N)、硝态氮(NO-3-N)、亚硝态氮(NO-2-N)和正磷酸盐(PO3−443--P).总氮(包含水体中的藻类)、总磷(包含水体中的藻类)和泥样总氮、总磷按照标准方法测定(金相灿和屠清瑛,1990).2.3底泥中基因组dna的提取用GF/C滤膜过滤100mL水样(根据生物量大小调整水样体积),滤膜置于-20℃保存.滤膜基因组DNA提取按照Rinta-Kanto的方法进行(Rinta-Kantoetal.,2005),主要步骤如下:用灭菌剪刀将滤膜剪碎,放入2mL灭菌离心管中,加入600μL裂解液(40mmol·L-1EDTA,400mmol·L-1NaCl,50mmol·L-1Tris-hydrochloride,pH9.0),加入溶菌酶至终浓度为2mg·mL-1,37℃水浴30min,每隔10min轻轻颠倒离心管数次,取出离心管加入蛋白酶K(100μg·mL-1)和SDS(2%),50℃水浴2～3h,每隔30min颠倒离心管数次.水浴后取出离心管冷却至室温,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1,体积比)抽提,13000r·min-1离心10min,将上清液转移至一新离心管中,加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1,体积比),抽提2次,12000r·min-1离心15min,转移水相到新灭菌离心管中,加入2倍体积4℃预冷无水乙醇和0.1倍体积10mol·L-1醋酸铵溶液,-20℃放置过夜.13000r·min-1离心15min沉淀DNA,小心倾掉上清液,用70%乙醇洗涤2次,室温自然晾干,加入100μL灭菌超纯水溶解DNA.-20℃保存备用.先将泥样冻干,称取1.0g泥样提取底泥中基因组DNA,提取方法参照申慧彦的方法进行(申慧彦等,2004),基因组DNA溶于200μLTris-HCl-EDTA(TE,pH8.0)中,取出150μL,利用Mobio公司纯化试剂盒(Mobio-12877)进行纯化,该过程能够有效去除各种PCR抑制剂(腐殖质、有机酸等).纯化后基因组进行QPCR分析.2.4pc-igs基因扩增利用室内培养的产毒微囊藻Microcystisaeruginosa7806构建定量PCR标准曲线,该藻种由中国科学院典型培养物种保藏委员会淡水藻种库(FACHB)提供.培养基为BG-11,培养温度为25℃,光照强度为40μmol·m-2·s-1,光照周期为12h/12h.离心收集处于对数生长期的藻细胞,按照文献方法(Rinta-Kantoetal.,2005)提取基因组DNA,用BioPhotometerPlus(Effendorf)测定DNA浓度和纯度(ABS260/ABS280),该藻株基因组大小为5.2MB,单个碱基的平均摩尔分子量是660g·mol-1,标准DNA浓度中含有目的基因的拷贝数可以用下面的公式计算(Vaitomaaetal.,2003):标准DNA浓度(copies·mL-1)=6×1023(copies·mol-1)×DNA浓度(g·mL-1)/基因组分子量(g·mol-1).设置6个标准浓度梯度(10倍梯度稀释),每个浓度3个平行.引物188F(5′-GCTACTTCGACCGCGCC-3′)与254R(5′-TCCTACGGTTTAATTGAGACTAGCC-3′)特异性扩增微囊藻微囊藻藻蓝蛋白转录间隔区(PC-IGS)用于总微囊藻种群定量化研究(KurmayerandKutzenberger.,2003),引物M1r-F(5′-AGCGGTAGTCATTGCATCGG-3′)和M1r-R(5′-GCCCTTTTTCTGAAGTCGCC-3′)特异性扩增产毒微囊藻微囊藻mcyA基因,用于产毒微囊藻定量化研究(Yoshidaetal.,2007).QPCR反应体系25μL,其中含有12.5μL2×SYBRpremixExTaqTM混合液(TaKaRa),1pmol引物,2μL模板,超纯水补足25μL.PCR反应在replex4(Eppendorf)荧光定量PCR仪上完成.PC-IGS基因扩增程序如下:95℃预变性2min,95℃变性20s,56℃退火30s,72℃延伸30s,40个循环.McyA基因扩增程序如下:95℃预变性2min,95℃变性20s,58℃退火30s,72℃延伸20s,40个循环.最后进行溶解曲线(meltingcurve)分析.实验结果Mastercycleepreplex软件分析.定量PCR扩增效率e(Amplificationefficiency)=10-1/s-1,S代表标准曲斜率.2.5数据处理和分析用MicrosoftExcel2003对数据进行处理和分析,结果用平均值±标准差表示.3结果结果3.1营养盐和总氮采样时间在上午8:00至11:00之间进行,风速在3.0m·s-1上下.采样点营养盐浓度如表1所示.可以看出,竺山湾(N5)和梅梁湾(N2)营养盐水平显著高于湖心(S4)和贡湖湾(N4),尤其是总磷和正磷酸盐浓度.采样期间平均水温为30.5℃,DO为6.70～7.13mg·L-1,pH值为7.87～8.40,电导率为0.20～0.47mS·cm-1,浊度为10.4～90.0NTU.底泥中梅梁湾(N2)和竺山湾(N5)总氮和总磷浓度高于贡湖湾和湖心.3.2pcr扩增效率实验McyA和PC-IGS基因定量PCR标准曲线如图2所示,循环阈值Ct(thresholdcycle)和DNA浓度对数值(log10D,D为基因组拷贝数)之间呈线性关系.PC-IGS定量PCR标准曲线方程Y=-3.36X+39.54(R2=0.99,p<0.01),斜率S为-3.36,扩增效率e为0.98.mcyA基因定量PCR标准曲线方程Y=-3.50X+37.36(R2=0.99,P<0.01),曲线斜率S为-3.50,扩增效率e为0.93.其中Y表示定量PCR反应循环阈值,X表示基因组拷贝数对数值.溶解曲线分析显示(数据未给出),定量PCR扩增产物为目的产物,而非引物二聚体.说明实验结果具有可靠性.3.3种类型种群丰度根据QPCR结果可以得出(图3),水华期间湖区间微囊藻种群丰度及其组成差异明显,富营养化严重的梅梁湾和竺山湾,产毒微囊藻和总微囊藻种群丰度比贡湖湾和湖心要高,其中竺山湾产毒微囊藻和总微囊藻种群丰度分别为8.28×106和2.01×107copies·mL-1,湖心区产毒微囊藻和总微囊藻种群丰度最低,分别为4.08×104和4.36×105copies·mL-1,种群丰度相差达2个数量级.湖区间产毒微囊藻占总微囊藻的比例也不同,竺山湾和梅梁湾该比值较高,分别为41.21%和40.25%,贡湖湾为28.53%,湖心最低,为9.36%.3.4底泥中微囊藻种丰度及其组成从图4可以看出,在太湖蓝藻水华发生期间,表层底泥中微囊藻种群丰度仍然较高.其中梅梁湾产毒微囊藻与总微囊藻种群丰度最高,分别为2.89×105和3.41×106copies·g-1(dryweight).湖心产毒微囊藻与总微囊藻种群最低,分别为3.83×103和1.52×105copies·g-1(dryweight).与水体相比,底泥中产毒微囊藻占总微囊藻种群比例较低.梅梁湾、竺山湾、贡湖湾和湖心该比值分别为8.49%、6.51%、5.14%和2.22%.可以看出,底泥中微囊藻种群丰度及其组成与水体微囊藻种群丰度及其组成没有直接关系.4水体富营养水平与产毒微囊藻和总微囊藻种群丰度的关系荧光定量PCR技术在蓝藻水华研究中应用已相当广泛.利用微囊藻毒素合成基因家族成员为研究对象,对水华期间产毒微囊藻种群进行定量化研究,能够快速确定蓝藻水华毒性,对蓝藻水华的生态风险做出评价(Baxaetal.,2010).建立目标DNA片段定量PCR标准曲线是应用定量PCR技术分析野外样品中目标生物种群丰度的基础,扩增效率e是评价定量PCR实验结果的重要指标之一.在实际应用中,定量PCR扩增效率在0.80～1.15之间才能满足实验要求(Zhangetal.,2006).在本实验中,分别构建了微囊藻毒素合成基因mcyA和藻蓝蛋白转录间隔区PC-IGS序列的定量PCR标准曲线,用于定量化研究产毒微囊藻和总微囊藻种群丰度.mcyA和PC-IGS序列定量PCR标准曲线扩增效率分别为0.93和0.98,满足了定量PCR实验的要求.为了减少底泥样基因组样品中PCR反应抑制剂对定量PCR造成的影响,对泥样基因组进行了纯化,虽然增加了实验成本,但是保证了实验结果的准确性.本研究应用QPCR技术对太湖蓝藻水华期间产毒微囊藻和总微囊藻种群丰度进行研究.结果表明,不同湖区产毒微囊藻与总微囊藻种群丰度及其比例关系差异显著:处于超富营养化状态的梅梁湾和竺山湾,产毒微囊藻和总微囊藻种群丰度显著高于贡湖湾和湖心,产毒微囊藻占总微囊藻比例分别为41.21%和40.25%,贡湖湾和湖心产毒微囊藻占总微囊藻种群的比例相对较低,分别为28.53%和9.36%,具有明显的空间差异性.这说明水体的富营养水平对产毒微囊藻和总微囊藻种群丰度分布具有重要影响,营养盐浓度高的湖区产毒微囊藻和总微囊藻种群丰度高于低营养盐湖区,产毒微囊藻所占总微囊藻种群的比例也较高.在对其它一些湖泊研究中,发现了类似的现象.Rinta-Kanto等研究了伊利湖(Erie)水华期间蓝藻、微囊藻和产毒微囊藻种群丰度分布特征及其与环境因子关系,发现随TP浓度增加,总微囊藻种群丰度和产毒微囊藻种群丰度都随之增加,产毒微囊藻占总微囊藻种群的比例波动范围从6.5%到59.5%(Rinta-Kantoetal.,2009).Yoshida等调查了日本Mikata湖产毒微囊藻与总微囊藻种群丰度随季节变化特征,发现产毒微囊藻占总微囊藻种群的比值范围为0.5%到35%,该比值与硝态氮(NO-3-N)浓度呈显著正相关,而与正磷酸盐(PO3−443--P)浓度和水温无关(Yoshidaetal.,2007).Davis等通过N、P添加实验证明,随N、P浓度增加,产毒微囊藻和非产毒微囊藻种群生长速率率增加,微囊藻种群丰度也随之提高,产毒微囊藻生长速率高于非产毒微囊藻,产毒微囊藻占总微囊藻种群的比例也提高(Davisetal.,2009).当然,除营养盐水平外,其它一些环境因子,比如温度、光照等都能对产毒微囊藻种群丰度及其占总微囊藻种群比例产生影响(Davisetal.,2009;Kardinaaletal.,2007).同时,生物间相互作用也能对微囊藻种群起调控作用,Yoshida等从水体中分离到一种感染产毒微囊藻的噬菌体,随微囊藻水华发展阶段其种群丰度也随之变化,对产毒微囊藻种群起到控制作用(Yoshidaetal.,2006).因此,营养盐浓度是决定产毒微囊藻种群和非产毒微囊藻种群丰度分布的因子之一.底泥是微囊藻重要的分布场所,随季节的变化,其种群丰度变化很大.对于浅水湖泊而言,底泥中微囊藻种群生物量波动更大,这可能和浅水湖泊更有利于微囊藻复苏(Brunbergetal.,2003).对底泥中微囊藻种群动态的研究,重点集中在蓝藻复苏过程及底泥蓝藻复苏对水柱中蓝藻生物量的贡献,而对蓝藻水华暴发期间底泥微囊藻种群动态变化及其影响因子研究较少.吴晓东等研究了太湖蓝藻越冬和复苏过程,发现底泥蓝藻复苏过程中生物量逐渐增加(3～5月份),然后迅速下降(吴晓东等,2008).张晓峰等研究发现太湖底泥蓝藻复苏一般从3月份开始,6月份结束,底泥表面微囊藻复苏进入水体,蓝藻上浮量占浮游藻类最大生物量的