第12章-1 重组DNA技术

第12章重组DNA技术本章内容提要1)重组DNA与限制性内切酶2)大肠杆菌质粒克隆载体的结构3)如何构建基因文库4)分子杂交的原理与程序5)如何从基因文库中筛选基因什么是重组DNA

?分子刀-DNA限制性内切酶限制性内切酶是一类在原核生物中发现的可以识别特定的DNA碱基顺序并将其切开的酶.限制性核酸内切酶的特点1)限制性核酸内切酶仅在原核生物中发现.2)限制性核酸内切酶识别的碱基顺序长度不等,可从4碱基对到数十碱基对.大多数常用的限制酶识别的碱基对长度为4-6个碱基对.3)限制性核酸内切酶切割DNA的方式可以是5’突出单链或3’突出单链,也可以是平端酶切.4)大多数II型限制性核酸内切酶识别的碱基顺序都有回文对称的特点,即旋转1800,识别顺序重叠.5)细菌中的限制核酸内切酶可以将外源的DNA切割,但不酶切自身的DNA.因为细菌基因组DNA可以甲基化,使限制酶不能识别而得以保护.发现限制性内切酶1)1950年代科學家發現了大腸桿菌K具有某種機制可以限制λ噬菌體的感染能力.2)1962年瑞士的科學家WernerArber等人證明了大腸桿菌K可以產生一種酶，可以阻止λ噬菌體的感染能力,因而稱為限制性内切酶(restrictionendonuclease

).3)在1970年美國科學家HamiltonO.Smith等人从噬血感菌RD菌株中分離出另一種限制酶,定名為HindII,为II型限制酶,目前常使用的限制酶均屬於這一類.4)在1971年美國科學家DanielNathans等人，首先利用

HindII限制酶描繪出

simianvirus40(SV40)病毒的限制酶位点物理图.基於限制酶的發現及其性質方面研究的貢獻，WernerArber、HamiltonO.smith、DanielNathans三人在1978共同获得諾貝爾生理醫學獎。限制酶发现及其应用获得诺贝尔奖有三种限制性内切酶目前已知有三种限制性内切酶:1)I型限制性内切酶:一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的蛋白复合体,可催化宿主DNA的甲基化

。它们在识别位点約1000bp以外的任何位置切割DNA链,不产生确定的限制片段和明确的条带.

2)II型限制性内切酶:在识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段和条带，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的酶。3)III型限制性内切酶:兼有限制和修饰两种功能的酶,可催化宿主DNA的甲基化

。它们在识别位点之外25-27bp的位置切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列,如BcgI,CGANNNNNNTGC

；它们很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值。

几种常用的II型限制酶及其识别位点限制酶识别与酶切的碱基顺序具有回文结构,旋转1800C可以顺序重叠,产生的突出末端称为粘性末端.平端切口不产生突出单链末端.重组DNA的操作限制酶切割DNA暴露的突出末端顺序又称粘性末端,具有相同突出末端的片段可以彼此连接.第一个重组DNA分子

1972年斯坦福大学的PaulBerg博士首次在国际上构建第一个重组DNA分子,它们结合了两种生物的DNA.为此,Berg荣获1980年化学诺贝尔奖.重组DNA与原子核裂变的意义可以相提并论.上世纪70年代中期,美国国家科学院要求Berg就重组DNA的安全性进行评估.为此,Berg写了一封具有历史意义的信件,号召推迟重组DNA研究,直到安全性得到控制为止.他是1975年在加洲Asilomar召开的国际重组DNA技术论坛的关键组织者.一百多位与会科学家讨论了基因剪切实验的潜在风险.一年后,讨论结果形成了关于重组DNA技术的NIH准则,这是一个里程碑式的事件,显示了科学家们负责任的自律精神.

Berg博士1991年被聘为人类基因组计划科学顾问委员会主席.第一个重组DNA生物

In1973,HerbertBoyer和

StanleyCohen创造了第一个

重组DNA生物----含有猿猴病毒SV40基因的大肠杆菌细胞.1975年Swanson访问了在硅谷的Boyer,讨论成立生物技术公司的想法.

1976年Boyer和Swanson共同创办了世界上第一家生物技术公司,Genentech.1978年他们生产了第1个重组DNA商用医药产品—人体胰岛素(治疗糖尿病),次年生产了第2个重组DNA产品—生长因子(治疗侏儒症).注:StanleyCohen因发现细胞生长因子,获1986年诺贝尔奖.9]

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DNA克隆什么是克隆(cloneorcloning)?1)Agroupofgeneticallyidenticalindividualsdescendedfromthesameparentbyasexualreproduction.2)Agroupofgeneticallyidenticalcellsproducedbymitoticdivisionfromanoriginalcell.3)AgroupofDNAmoleculesproducedfromanoriginallengthofDNAsequencesproducedbyabacteriumoravirususingmolecularbiologytechniques.ThisiswhatisoftencalledmolecularcloningorDNAcloning.

4)Theproductionofgeneticallyidenticalanimalsby'embryosplitting'.Thiscanoccurnaturallyatthetwocellstagetogiveidenticaltwins.5)Thecreationofoneormoregeneticallyidenticalanimalsbytransferringthenucleusofabodycellintoaneggfromwhichthenucleushasbeenremoved.核移植,多利羊定义:通过无性方式产生的遗传组成相同的后代(DNA,细胞,个体).DNA分子克隆载体(Vector)一种可以将插入DNA片段进行扩增的质粒DNA,含有可在原核或真核细胞中复制所必需的元件.大肠杆菌质粒DNA1)大肠杆菌细胞中含有游离于染色体外并且可以独立复制的遗传物质—质粒DNA.2)质粒DNA一般是小分子环状DNA分子.3)大肠杆菌细胞中的质粒DNA通常有很多个拷贝,因此可以用来扩增外源的DNA片段.4)质粒DNA可以提取出来进行体外操作,构建重组DNA分子.5)提取和纯化的质粒DNA可以用来转化大肠杆菌细胞,并可在宿主菌中进行多拷贝复制.DNA克隆载体的必需部件1)DNA复制起始点2)质粒载体选择标记3)多克隆位点质粒载体

的一般结构结构元件:1)复制起始点;2)质粒筛选标记;3)插入子筛选标记;3)多克隆位点.质粒DNA复制起始点与拷贝数1)DNA克隆载体必须在宿主菌细胞中复制才能进行扩增,因此克隆载体均含有可被宿主菌识别的复制起始点.2)不同的细菌DNA复制起始点具有种属专一性,因此可在甲种细菌中复制的克隆载体不一定能在乙种细菌中复制.3)可在多种宿主菌中复制的克隆载体称为穿梭载体,它们含有广宿主复制起始点.4)复制起始点决定细胞中拷贝数的多少:

松弛型质粒:一个细胞中可以复制数十个质粒拷贝,这种质粒为松弛型,常用于质粒扩增.

严谨型质粒:一个细胞中只允许一个或数个质粒拷贝,这种质粒为严谨型,基因工程中很少采用这类质粒.克隆载体选择标记克隆载体的选择标记具有两种类型,具有不同的功能:1)质粒选择标记,这类标记可使质粒DNA在选择压力下保留在细胞中,如大肠杆菌克隆载体中的抗卡那霉素基因(kamR)或抗氨卞青霉素基因(ampR).2)插入子选择标记,根据筛选标记的表型可以判断外源DNA是否已插入到克隆载体中,如大肠杆菌克隆载体中常用的lacZ基因.若无外源DNA插入,在筛选培养基上克隆显示蓝色.在外源DNA插入破坏lacZ基因时,克隆显示白色.插入子选择标记1)插入子选择标记基因lacZ编码降解乳糖糖苷键的酶,它也能降解一种IPTG的化合物,并产生一种蓝色的物质.2)在筛选培养基中加入IPTG,如果细菌能产生lacZ蛋白质,细胞内有蓝色产物积累,表明载体中的标记基因lacZ是正常的,没有插入外源DNA.这些蓝色克隆为阴性克隆.3)如果细菌不产生lacZ蛋白质,细胞内没有蓝色产物积累,表明载体中的标记基因lacZ受到破坏,已有外源DNA插入.这些白色克隆为阳性克隆.多克隆位点1.所有克隆载体都有多克隆位点,它们是外源DNA插入的位置.多克隆位点由一段特别的碱基顺序组成,它们可以由不同的限制酶切开.含有相同接头的外源DNA可通过互补接头插入到载体的多克隆位点中.2.采用多克隆位点的目的是为了便于不同顺序的外源DNA整合到载体中.3.当外源DNA顺序中没有合适的酶切位点时,可以合成匹配的接头整合到载体中.常用的DNA克隆载体

DNA

克

隆

的一般程序筛选目标克隆DNA分子杂交—Southern分析1.DNA双螺旋的两条单链是按碱基互补配对(A/T和C/G)的原则形成的.在高于950C(或酸碱条件)下,DNA两条双链会彼此分开形成单链,这一过程称为