富硒灵芝调控大鼠乙酰辅酶A羧化酶α表达治疗非酒精性脂肪肝病的研究

富硒灵芝调控大鼠乙酰辅酶A羧化酶α表达治疗非酒精性脂肪肝病的研究

武俊紫，贾亚敏，沈平瑞，胡跃高，全胜麟，李燕*，李树德1昆明理工大学昆华医学院，昆明650504;2云南省第一人民医院干部保健科，昆明650031;3太原理工大学现代科技学院，太原030021;4沈阳康硒生物工程研究所，沈阳110015;5中国农业大学农学与生物技术学院，北京100094;6昆明医科大学基础医学院，昆明650504硒(Selenium，Se)是人体必需的微量元素之一［1］，其在肝脏内是构成谷胱甘肽过氧化物酶(GlutathionePeroxidase，GSH-Px)的重要成分之一。人体内硒的主要来源为食物，但富硒食品相对较少。灵芝(Ganoderma)是药食两用菌，属于珍贵的药用真菌之一，具有养心安神、补气益血、补肺平喘、滋补强壮、扶正固本等功效，同时灵芝对某些微量元素特别是硒具有高度的富集作用，可以将水中添加无机硒转化为有机硒，利于人体摄入［2］。本实验采用富硒灵芝治疗非酒精性脂肪肝病(Non-AlcoholicFattyLiverDisease，NAFLD)大鼠，现对治疗前后大鼠SREBF1、ACCα及其相关因子做统计分析。1材料与方法1.1材料1.1.1动物60只雄性清洁级SD大鼠［合格证号:SYXK(滇)2011-0004］，体重160～180g，动物、基础饲料以及饲养用垫料均由昆明医科大学动物实验部提供。1.1.2高脂溶液配制与灌胃量97%猪油、2%胆固醇与1%胆酸钠配置100%高脂溶液，大鼠灌胃时采用16mm灌胃针头，大鼠灌胃量为每100g大鼠体重灌1mL高脂溶液，每天早上灌胃一次，另模型对照组和富硒灵芝治疗组在造模全程内日常饮水均为10%的红糖水。1.1.3药品与试剂富硒灵芝(含硒量为3.162mg/kg)，由沈阳康硒生物工程研究所提供。胆固醇购自北京鼎国生物技术公司，胆酸钠购自上海金穗生物公司，猪油和红糖市场自购;血糖、GSH、MDA、SOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所;ALT、AKP、r-GT、胰岛素以及AST等相关ELISA试剂盒购自Bio-Swamp公司，LDH试剂盒购自上海谷研实业有限公司，鼠抗兔多克隆抗体SERBF-1、ACCα和ECL发光试剂盒购自美国SantaCruz公司，相应二抗购于中杉金桥公司。1.2方法1.2.1非酒精性脂肪肝模型的建立及给药方法60只SD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、富硒灵芝组，造模成功后富硒灵芝组每只大鼠每次给予富硒灵芝水5mL(1g富硒灵芝+10mL水煮沸0.5h，冷却过夜浸泡)，每天灌胃二次，模型对照组给予相应生理盐水灌胃参照，空白对照组则不加以任何干涉，分别与6周和12周处死大鼠各半，测定其相应指标。1.2.2标本的采集用3%水合氯醛腹腔内注射麻醉，麻醉后无菌操作暴露腹腔，10mL注射器心脏迅速取血;血液离心，取上清液，-86℃保存;肝脏称取100mg用于匀浆提取上清液，其余-86℃保存。1.2.3病理学检查方法取肝左叶，10%中性福尔马林溶液固定，肝脏组织酒精脱水，石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察肝脏病理学改变，并采取不同视野，每个切片照四张像。1.2.4相关指标检测方法GSH以及血糖的测定方法为酶法，MDA测定方法为TBA法，SOD的测定方法为WST-1法，LDH、ALT、AKP、r-GT、胰岛素以及AST测试方法为双抗体夹心法。1.2.5RT-PCR检测SERBP-1、ACCαmRNA的表达取肝脏组织15mg，用天根总RNA提取试剂盒提取总RNA，定量后每组各取2μg逆转录cDNA，然后用逆转的cDNA2μL为模板，采用PCRMaster-Mix试剂进行PCR反应扩增SERBP-1和ACCα目的片段。PCR扩增反应条件如下:98℃预变性2min，98℃变性10s、SERBP-1为46.6℃退火(ACCα为47.8℃退火)30s、72℃延伸35s，循环次数34次;最后再延伸5min。PCR反应产物在含核酸染料(1μL核酸染料配比100mL琼脂糖溶液)的1.6%琼脂糖凝胶中电泳30min，电压110V，电泳完成后用凝胶成像仪拍照采集图像，ImageJ软件计算各条带的荧光强度值，以β-actin作为内参进行标准对照。每组实验重复3次。SERBP-1引物设计为:PrimerA:5'CGTTCGCCATAACCAAGTAGAG3'，PrimerB:5'GGCGATGCTGTACACTGTTGA3'，产物长度为126bps。ACCα引物设计为:PrimerA:5'AGCGCTACCGTTCCTCTATCAA3'，PrimerB:5'GCTGTAAGAAGCGGATGTAGTCG3'，产物长度为118bps。β-actin引物设计为:PrimerA:5'GTGACGAGGCCCAGAGCAAGAG-3'，PrimerB:5'ACGCAGCTCATTGTAGAAGGTGTGG-3'，产物长度为123bps。1.2.6WesternBlot检测SERBP-1、ACCα蛋白的表达取肝脏组织100mg用组织细胞裂解液制作匀浆，BCA法测定蛋白质含量，取样本SERBP-1为100μg(ACCα为60μg)进行SDS电泳，半干转法将蛋白转移至PVDF膜，5%的脱脂牛奶封闭2h后加入相应多克隆一抗，摇床剧烈摇半小时后4℃过夜，洗膜3次，每次15min，加入相应的HRP标记的二抗孵育，洗涤后与ECL发光试剂反应，曝光洗片，扫描图像后用ImageJ软件计算各条带的灰度值，以βactin作为内参进行标准对照。每组实验重复3次。1.3统计学处理所有的数据均用SPSS19.0统计软件进行处理分析。计量资料均以均数±标准差()表示。多组间两两比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Tamhane'sT2法。检验水准=0.05。2实验结果2.1大鼠肝脏HE染色比较图HE染色可明显看出，模型对照6周组出现不同程度的脂肪变性及空泡样变，肝细胞极度肿胀呈圆形，体积较空白对照6周组明显增大;富硒灵芝6周组脂肪变性程度及细胞肿胀明显减轻，炎性细胞浸润及坏死灶较模型对照组明显减少，空白对照6周组看不到任何脂滴及坏死特征;12周组大鼠肝脏三个组HE染色图片基本情况与6周组相似，但富硒灵芝12周组组比较富硒灵芝6周组进一步好转，详见图1。图1大鼠肝脏HE染色Fig.1HEstainingofratliver2.2大鼠肝功能比较2.2.1治疗6周后大鼠肝功能比较治疗6周后大鼠LDH、AST以及ALT富硒灵芝6周组与模型对照6周组相比，P＜0.05;碱性磷酸酶(AKP)、r-谷氨酰转移酶(r-GT)富硒灵芝组与模型组相比，虽然没有统计学意义，但仍可以看出明显的变化，详见表1。表1各组大鼠肝功能治疗6周指标比较(n=10，)Table1Comparisonofliverfunctionindicatorsofdifferentgroupswith6weeks’treatment(n=10，)表1各组大鼠肝功能治疗6周指标比较(n=10，)Table1Comparisonofliverfunctionindicatorsofdifferentgroupswith6weeks’treatment(n=10，)注:与模型对照组比较，*P＜0.05。Note:Comparewithmodelcontrolgroup，*P＜0.05.2.2.2治疗12周后大鼠肝功能比较治疗12周后大鼠LDH与AST、ALT富硒灵芝12周组与模型对照12周组相比，P＜0.05，AKP与r-GT富硒灵芝12周组与模型对照12周组相比，无统计学意义，详见表2。表2各组大鼠肝功能治疗12周指标比较(n=10，)Table2Comparisonofliverfunctionindicatorsofdifferentgroupswith12weeks’treatment(n=10，)表2各组大鼠肝功能治疗12周指标比较(n=10，)Table2Comparisonofliverfunctionindicatorsofdifferentgroupswith12weeks’treatment(n=10，)注:与模型对照组比较，*P＜0.05。Note:Comparewithmodelcontrolgroup，*P＜0.05.2.3大鼠氧化和抗氧化能力比较2.3.1治疗6周后大鼠氧化和抗氧化能力比较富硒灵芝6周组血清GSH、血清MDA、肝脏SOD、肝脏MDA以及肝脏GSH与模型对照组比较有明显的统计学意义，P＜0.05，详见表3。表3治疗6周后大鼠氧化和抗氧化能力比较(n=10，)Table3Comparisonofoxidationandantioxidantcapacityofdifferentgroupswith6weeks’treatment(n=10，)表3治疗6周后大鼠氧化和抗氧化能力比较(n=10，)Table3Comparisonofoxidationandantioxidantcapacityofdifferentgroupswith6weeks’treatment(n=10，)注:与模型对照组比较，*P＜0.05。Note:Comparewithmodelcontrolgroup，*P＜0.05.2.3.2治疗12周后大鼠氧化和抗氧化能力比较富硒灵芝血清GSH、血清MDA、肝脏SOD、肝脏MDA、肝脏GSH与模型组相比P＜0.05，详见表4。表4治疗12周后大鼠氧化和抗氧化能力比较(n=10，)Table4Comparisonofoxidationandantioxidantcapacityofdifferentgroupswith12weeks’treatment(n=10，)表4治疗12周后大鼠氧化和抗氧化能力比较(n=10，)Table4Comparisonofoxidationandantioxidantcapacityofdifferentgroupswith12weeks’treatment(n=10，)注:与模型对照组比较，*P＜0.05。Note:Comparewithmodelcontrolgroup，*P＜0.05.2.4SREBF-1与ACCαmRNA表达2.4.1大鼠SERBF-1mRNA表达与模型对照组相比，富硒灵芝6周组大鼠肝脏SERBF-1的mRNA表达稍有改善，但差别无统计学意义(P＞0.05)。12周SERBF-1的mRNA表达与模型对照组相比有明显的统计学意义，经检验P＜0.05(图2)。图2肝脏组织中SREBF-1mRNA的表达Fig.2LiverSREBF-1mRNAexpression2.4.2大鼠ACCαmRNA表达与模型对照组相比，富硒灵芝6周组大鼠肝脏ACCα的mRNA表达即具有统计学意义(P＜0.05)。12周ACCα的mRNA表达几乎恢复到正常的水平，详见图3。图3肝脏组织中ACCαmRNA的表达Fig.3LiverACCαmRNAexpression2.5SREBF-1与ACCα酶蛋白表达2.5.1大鼠SERBF-1蛋白表达富硒灵芝6周组与模型对照6周组相比，差别具无统计学意义(P＞0.05);12周富硒灵芝组与模型对照组相比，差距具有统计学意义P＜0.05(图4)。2.5.2大鼠ACCα蛋白表达富硒灵芝6周组与模型对照6周组相比，差别具有统计学意义(P＜0.05);12周富硒灵芝组与模型对照组相比，差距也具有统计学意义，同时富硒灵芝12周组要明显的好于富硒灵芝6周组，几乎达到了空白对照组的水平(图5)。图4肝脏组织中SREBF-1蛋白的表达Fig.4LiverSREBF-1proteinexpression图5肝脏组织中ACCα蛋白的表达Fig.5LiverACCαproteinexpression图6空腹胰岛素抵抗指数Fig.6Fastinginsulinresistanceindex2.6空腹血糖胰岛素抵抗指数空腹胰岛素抵抗指数比较，6周时模型组大鼠明显要高于空白组，经富硒灵芝治疗后，只有略微的降低，12周时富硒灵芝组胰岛素抵抗指数与模型组相比呈现出统计学意义(P＜0.05)，详见图6。3讨论NAFLD在临床上指病变主体为肝小叶，以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征，但却无过量饮酒史的一种病理综合征，其疾病谱包括单纯性脂肪肝(nonalcoholicsimplefattyliver，NAFL)、脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，NASH)、及其相关脂肪性肝纤维化和肝硬化等［3］。2012年沈峰等［4］在上海国际消化系统疾病会议中报道显示在我国当前城市人口NAFLD的发生率约31%，我国贫困地区NAFLD的患病率也在12%左右。早期的研究认为，NAFLD预后良好，进展缓慢甚者基本不进展。但近来研究显示，NAFLD如果不加以治疗或预防，可导致约20%的NAFLD患者进展为肝硬化，其中30%～40%患者死于肝相关疾病［3］，因此当前NAFLD已成为威胁我国人民健康的疾病之一。NAFLD发病机理的研究，目前医学界普遍接受的是1998年Day［5］提出的“二次打击学说”，“二次打击学说”分为“第1次打击”和“第2次打击”二个部分，“第1次打击”即指脂肪在肝细胞内过量储积;有研究显示［6］，IR是NAFLD第一次打击的始动及中心环节，可能贯穿于NAFLD发病全过程。IR的高低与调节脂肪生成的转录因子SREBF-1密切相关［7］。胰岛素的高表达是造成SREBF-1升高的关键，SREBF-1是调节肝脏脂肪合成有关的酶，其过度表达可使ACCα的mRNA表达水平升高，ACCα主要参与脂肪酸的合成［8］，它是催化脂肪酸合成的第一步反应，即ACCα合成丙二酰辅酶A，丙二酰辅酶A在脂肪酸碳链延长酶系作用下合成长链脂肪酸，促进脂肪变性发生，造成脂肪颗粒在肝脏内聚集，从而导致非酒精性脂肪肝的发生。本文的研究结果提示:用富硒灵芝水给予高脂饮食造成的NAFLD大鼠治疗，胰岛素抵抗指数在6周时发生了微小改变，到12周时呈现出统计学意义，大鼠SREBF-1mRNA和蛋白变化趋势与胰岛素抵抗指数变化一致，而ACCαmRNA和蛋白表达则相当明显，其不仅6周即发生了明显的改变，12周时ACCα的表达几乎恢复到正常对照组的水平(P＜0.05)，分析原因可能是由于富硒灵芝在初始时不可以直接通过降低胰岛素抵抗来直接作用与大鼠SREBF-1基因的表达，但却可以明显抑制SREBF-1管控因子ACCα的表达，通过抑制大鼠ACCαmRNA和蛋白的表达，有效的保护了脂肪颗粒在肝脏内的积累，而在12周时，其SREBF-1的表达呈现出统计学意义(P＜0.05)，这可能是由于ACCα的降低，促进了肝脏脂肪颗粒的代谢，从而进一步反作用于SREBF-1的表达，综合提示:富硒灵芝可有效降低大鼠肝脏SREBF-1与ACCα的表达，从而减缓了首次打击带来的危害，以达到改善肝功能，保护肝脏的功效。氧化应激与脂质过氧化损伤是脂肪肝受到第二次打击进一步发展的重要因素［9］。当肝细胞内脂质过度堆积到一定程度时，就会出现以线粒体为中心的一条或多条途径促进氧化应激，导致脂质过氧化，最终加速肝细胞损伤，甚至导致肝细胞死亡及肝纤维化。超氧化物歧化酶(SOD)［10］是超氧离子自由基的专一特效金属歧化酶，通过清除自由基，起到保护机体的作用，它对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基，保护肝细胞免受损伤。脂质过氧化后产生MDA增加，MDA增加使细胞内抗氧化剂SOD消耗增加，含量显著性下降［11］。本文的研究结果显示:富硒灵芝治疗6周后，与模型对照组相比，血清GSH、血清MDA，肝脏SOD、肝脏GSH以及肝脏MDA相比，均发生了明显的改变，P＜0.05。富硒灵芝治疗12周后，血清GSH、血清MDA，肝脏SOD、肝脏GSH以及肝脏MDA5个指标与模型对照组相比，变化更加明显(P＜0.05)，其中肝脏SOD水平几乎回到了正常的水平，结合本次治疗后，肝功能水平的明显好转，综合提示:富硒灵芝可明显提高高脂饮食所诱导的非酒精性脂肪肝病抗氧化能力，降低肝脏二次打击的危害，有效的保护肝脏。综上所述，本文研究结果显示:富硒灵芝可通过抑制非酒精性脂肪肝病大鼠的肝脏组织ACCα蛋白的表达，同时减弱二次打击学说中第二次打击对肝脏的进一步伤害，以降低肝脏的氧化能力，提高抗氧化能力，从而达到降低肝异常指数，治疗非酒精性脂肪肝病，但本次治疗周期时间为12周，提示。富硒灵芝治疗非酒精性脂肪肝可能药效疗程较长，需长期服用。1XiangCG(向昌国)，LiWF(李文芳)，RenH(任浩)，etal.SeleniumcontentdeterminationinediblepartsofcropsinZhangjiajiecity.NatProdResDev(天然产物研究与开发)，2012，24:1084-1088.2YangY(杨洋)，WuXY(吴小勇)，ZhangZ(张湛)，etal.FermentationofGanodermalucidumforseleniumenrichmentandtheantioxidantcapabilityoftheproteinproduct.ModFoodSciTechnol(现代食品科技)，2010，26:1349-1353.3ZhuLX，BakerSS，GillC，etal.Characterizationofgutmicrobiomesinnonalcoholicsteatohepatitis(NASH)patients:AconnectionbetweenendogenousalcoholandNASH.Hepatology，2013，57:601-609.4TanwarS，TremblingPM，ThorburnD，etal.PWE-286Directserummarkersaremoreaccuratethansimplemarkerpanelsforthedetectionoffibrosisinnon-alcoholicfattyliverdisease(NAFLD).Gut，2012，61:A414.5ShenF(沈峰)，WangYQ(汪余勤)，FanGJ(范建高).2012Shanghaiinternationalmeetingofdigestivediseases.ChinJFrontiersMedSci，ElectrVer(中国医学前沿杂志.电子版)，2012，4:1-4.6DayCP.Steatoh